Protokol dan FAQ Imunofluoresensi (IF)

Imunofluoresensi (IF) merupakan metode eksperimen yang menggabungkan prinsip imunologi dan teknik fluoresensi. Metode ini banyak digunakan dalam penelitian biologi, terutama dalam biologi sel, biologi molekuler, dan patologi. Imunofluoresensi mendeteksi dan melokalisasi distribusi protein atau molekul tertentu dalam sel atau jaringan dengan mengikat antibodi tertentu ke antigen target dan dengan antibodi sekunder berlabel fluoresensi atau antibodi berlabel langsung.

Prinsip Imunofluoresensi

Imunofluoresensi menggunakan ikatan antara antibodi dan antigen spesifiknya untuk mengidentifikasi molekul target. Antibodi sangat spesifik terhadap antigen target dan dapat mengikat protein target atau molekul lain secara akurat. Antibodi biasanya ditempelkan dengan label fluoresensi (seperti FITC, Cy3, dll.). Pewarna fluoresensi ini dapat memancarkan cahaya tampak di bawah penyinaran cahaya eksitasi. Melalui pewarna fluoresensi yang berbeda, beberapa molekul target dapat dideteksi dalam sampel yang sama. Sampel diamati dengan mikroskop fluoresensi setelah pelabelan fluoresensi. Mikroskopi fluoresensi dapat membangkitkan pewarna fluoresensi pada panjang gelombang tertentu untuk memancarkan fluoresensi pada panjang gelombang tertentu, sehingga menunjukkan posisi molekul target dalam sel atau jaringan.

Tahapan Imunofluoresensi

Persiapan Sampel

Persiapan sampel merupakan langkah yang sangat penting dalam percobaan imunofluoresensi. Tujuannya adalah untuk memastikan bahwa molekul target tetap stabil dan antibodi dapat secara efektif memasuki sel atau jaringan untuk pelabelan. Sel atau potongan jaringan difiksasi dengan fiksatif (seperti formaldehida, asam asetat glasial, atau etanol) untuk menjaga integritas struktur sel sekaligus mencegah degradasi protein target. Fiksatif yang umum digunakan adalah paraformaldehida (PFA) 4%, yang dapat difiksasi pada suhu kamar dan biasanya memakan waktu 10-30 menit. Agar antibodi dapat menembus membran sel atau jaringan, surfaktan (seperti Triton X-100, Saponin atau Tween-20) biasanya digunakan untuk pengobatan osmotik. Penetran menghancurkan integritas membran sel, sehingga antibodi dapat memasuki sel. Untuk mengurangi pengikatan non-spesifik, sel atau potongan jaringan diblokir dengan larutan pemblokiran (biasanya buffer yang mengandung BSA (bovine serum albumin) atau serum hewan normal). Langkah ini biasanya berlangsung 30 menit hingga 1 jam.

Inkubasi Antibodi

Tahap inkubasi antibodi merupakan tahap kunci dalam imunofluoresensi, yang melibatkan pengikatan antibodi spesifik ke antigen target. Antibodi primer spesifik (yaitu antibodi yang mengikat antigen target) ditambahkan dan dibiarkan mengikat molekul target dalam sampel. Antibodi primer biasanya diinkubasi semalaman pada suhu 4℃ atau diinkubasi pada suhu ruangan selama 1-2 jam. Inkubasi antibodi sekunder (jika menggunakan imunofluoresensi tidak langsung): Jika imunofluoresensi tidak langsung digunakan, setelah antibodi primer mengikat antigen target, antibodi sekunder berlabel fluoresensi ditambahkan. Antibodi sekunder adalah antibodi terhadap antibodi primer, biasanya diekstraksi dari spesies yang berbeda, yang dapat meningkatkan sinyal.

Pencucian

Tahap pencucian adalah untuk membuang antibodi yang tidak terikat pada antigen dan mengurangi gangguan sinyal latar belakang. Cuci sampel beberapa kali dengan PBS (phosphate buffered saline) atau TBS (Tris buffered saline), biasanya 5-10 menit setiap kali, untuk membuang antibodi yang tidak terikat dan kotoran lainnya.

Pewarnaan Fluoresensi

Pada langkah ini, molekul target dalam sel atau jaringan akan ditunjukkan oleh antibodi berlabel fluoresensi.

Jika metode imunofluoresensi tidak langsung digunakan, antibodi sekunder akan memberi label pada pewarna fluoresensi. Pewarna fluoresensi yang umum digunakan meliputi FITC (fluorescent isothiocyanate green), Cy3 (red), pewarna seri Alexa Fluor, dll.

Contoh Segel

Untuk memudahkan pengamatan dan mencegah sampel mengering atau rusak di bawah mikroskop, biasanya perlu menggunakan cairan penyegel untuk menyegel film. Sampel disegel menggunakan larutan penyegel yang mengandung peredam antifluoresensi (seperti larutan penyegel yang mengandung DAPI). Larutan penyegel tidak hanya dapat melindungi sampel dari pengaruh lingkungan eksternal, tetapi juga meningkatkan sinyal fluoresensi.

Pengamatan Mikroskop Fluoresensi

Terakhir, sampel diamati menggunakan mikroskop fluoresensi. Mikroskop fluoresensi dapat mengeksitasi zat warna fluoresensi dalam sampel dan mendeteksi distribusi molekul target. Zat warna fluoresensi memancarkan cahaya tampak dengan panjang gelombang tertentu melalui sumber cahaya eksitasi (biasanya cahaya ultraviolet atau cahaya biru). Berbagai zat warna fluoresensi memiliki panjang gelombang eksitasi dan emisi yang berbeda, dan beberapa target pelabelan dapat diamati melalui filter yang berbeda.

1Persiapan sampel: tetap, infiltrasi, tertutup.
2Inkubasi antibodi: antibodi primer (atau antibodi primer dan sekunder) ditambahkan.
3Pencucian: Menghilangkan antibodi yang tidak terikat.
4Pewarnaan fluoresensi: pewarna fluoresensi berlabel.
5Penyegelan: gunakan cairan penyegel untuk menyegel film.
6Pengamatan mikroskop fluoresensi: Amati dan catat sinyal fluoresensi.

Gambar 1. Imunofluoresensi langsung. (Sumber referensi:Pengenalan Pewarnaan Imunofluoresensi.)

Gambar 2. Imunofluoresensi tidak langsung.Sumber referensi: Pengantar Pelaksanaan Pewarnaan Imunofluoresensi.)

Gambar 3. Amplifikasi sinyal dengan antibodi sekunder poliklonal yang diberi label fluorofor. (Sumber referensi:Pengantar Pelaksanaan Pewarnaan Imunofluoresensi.)

Gambar 4. Amplifikasi sinyal oleh antibodi sekunder yang dikonjugasikan dengan beberapa kompleks protein fluorofor. (Sumber referensi:Pengenalan Pewarnaan Imunofluoresensi.)

Gambar 5. Amplifikasi sinyal dengan antibodi sekunder poliklonal yang dikonjugasikan dengan beberapa kompleks fluorofor–protein. (Sumber referensi:Pengenalan Pewarnaan Imunofluoresensi.)

Keuntungan Imunofluoresensi

Sensitivitas tinggi: Pelabelan fluoresensi memiliki sensitivitas tinggi dan dapat mendeteksi protein atau molekul yang diekspresikan rendah.

Lokalisasi spasial: Dapat dengan jelas menunjukkan lokasi dan distribusi spesifik protein target dalam sel atau jaringan.

Pelabelan ganda: beberapa protein target dapat dideteksi secara bersamaan, dan pelabelan ganda dapat dicapai dengan menggunakan pewarna fluoresensi dengan panjang gelombang berbeda.

Non-invasif: Mengamati sampel biologis dengan cara non-invasif tidak akan mengubah struktur sampel.

Aplikasi Imunofluoresensi

Lokalisasi Protein

Distribusi protein target dalam sel, seperti membran sel, nukleus, sitoplasma, dll., dapat ditentukan lokasinya dengan imunofluoresensi.

Analisis Sel dan Jaringan

Imunofluoresensi dapat digunakan untuk menganalisis ekspresi protein spesifik dalam sel dan potongan jaringan.

Analisis Ko-lokalisasi

Kolokalisasi dan interaksi berbagai protein dapat diamati melalui berbagai pelabelan dan warna pewarna fluoresensi yang berbeda.

Penelitian Penyakit

Imunofluoresensi digunakan untuk mendeteksi penanda patologis dan protein abnormal pada kanker, penyakit neurologis, penyakit imun, dan penelitian lainnya.

Alpha Lifetech menyediakan layanan imunofluoresensi untuk membantu pelanggan mencapai analisis visual yang akurat dari molekul target, membantu peneliti memahami secara mendalam proses biologi sel dan mekanisme penyakit, dan kemudian mempromosikan pengembangan penelitian biomedis dan diagnosis klinis.

Tanya Jawab Umum

1. Dalam percobaan imunofluoresensi, sinyal latar belakangnya kuat, sehingga mustahil untuk mengamati molekul target dengan jelas.

Solusi: (1) Pemblokiran tidak tuntas: Pastikan penggunaan larutan pemblokiran yang tepat (seperti BSA, serum normal, dll.), dan pemblokiran cukup lama (30 menit hingga 1 jam) untuk mencegah pengikatan nonspesifik. (2) Konsentrasi antibodi terlalu tinggi: kurangi konsentrasi antibodi primer atau sekunder untuk menghindari pengikatan nonspesifik. Pencucian tidak memadai: Tingkatkan jumlah dan waktu pencucian untuk memastikan penghilangan antibodi yang tidak terikat. (3) Gunakan antibodi berkualitas tinggi: pilih antibodi dengan spesifisitas kuat dan afinitas tinggi untuk mengurangi kemungkinan pengikatan nonspesifik.
2. Sinyal fluoresensi lemah atau tidak dapat dideteksi, sehingga molekul target tidak terlihat.

Solusi: (1) Konsentrasi antibodi terlalu rendah: tingkatkan konsentrasi antibodi primer atau antibodi sekunder untuk memastikan bahwa antibodi dapat sepenuhnya mengikat antigen target. (2) Kualitas antibodi berlabel fluoresensi buruk: Pilih antibodi berlabel fluoresensi berkualitas tinggi untuk memastikan intensitas fluoresensi dan stabilitas pewarna. (3) Masalah fiksasi sampel: Pastikan bahwa langkah fiksasi cukup untuk menghindari degradasi atau perubahan konformasi molekul target selama proses fiksasi. (4) Redaman fluoresensi pewarna fluoresensi: penggunaan agen redaman anti-fluoresensi dari larutan penyegel, untuk mencegah redaman sinyal fluoresensi dari waktu ke waktu.
3. Sampel mungkin terkontaminasi, sehingga menghasilkan hasil eksperimen yang tidak akurat atau tidak dapat diandalkan.

Solusi : (1) Pengoperasian yang tidak bersih : pastikan semua peralatan dan reagen yang digunakan dalam percobaan bersih dan hindari kontaminasi silang. (2) Gunakan reagen baru : Ganti reagen secara teratur untuk menghindari hasil yang tidak stabil yang disebabkan oleh penuaan atau kerusakan reagen. (3) Hindari pengeringan sampel : Jaga agar sampel tetap lembab selama operasi untuk mencegah sampel mengering sebelum mikroskop fluoresensi.
4. Pengikatan antibodi terhadap antigen target tidak spesifik, yang dapat menyebabkan hasil positif palsu atau negatif palsu.

Solusi : (1) Pilih antibodi berkualitas tinggi : Beli antibodi yang sudah terbukti dan berkualitas tinggi, atau buat antibodi yang sepenuhnya tervalidasi. (2) Optimalisasi kondisi inkubasi antibodi : Sesuaikan waktu inkubasi, konsentrasi dan suhu antibodi untuk memastikan efek pengikatan terbaik. (3) Kontrol negatif : Spesifisitas antibodi diverifikasi dengan menambahkan kontrol negatif (misalnya, serum non-imun atau antibodi yang tidak terkait).
5. Setelah langkah fiksasi sel atau jaringan, antibodi tidak dapat memasuki sel atau jaringan dengan lancar.

(1) Perlakuan osmotik yang tepat: Perlakuan osmotik dilakukan dengan menggunakan surfaktan (seperti Triton X-100 atau Saponin) sehingga antibodi dapat masuk ke dalam sel. (2) Pilih fiksatif yang tepat: Pastikan fiksatif menstabilkan struktur sel tanpa mempengaruhi masuknya antibodi.

referensi

[1] Im K, Mareninov S, Diaz MFP, Yong WH. Pengantar Pewarnaan Imunofluoresensi. Metode Mol Biol. 2019;1897:299-311. doi:10.1007/978-1-4939-8935-5_26

[2] Odell ID, Cook D. Teknik imunofluoresensi. J Invest Dermatol. 2013;133(1):e4. doi:10.1038/jid.2012.455

[3] Aros CJ. Imunofluoresensi Tidak Langsung pada Potongan Jaringan. Metode Mol Biol. 2022;2386:17-26. doi:10.1007/978-1-0716-1771-7_2

[4] Maecker HT, Maino VC, Picker LJ. Analisis imunofluoresensi respons sel T pada kondisi sehat dan sakit. J Clin Immunol. 2000;20(6):391-399. doi:10.1023/a:1026403724413