Protokol dan FAQ Imunohistokimia (IHC)

Imunohistokimia (IHC) merupakan teknik yang banyak digunakan dalam biologi sel dan patologi. Teknik ini melakukan pelokalan dan analisis kuantitatif protein, antigen, atau penanda molekuler tertentu dengan menggunakan ikatan spesifik antara antibodi dan antigen target serta menggabungkan analisis morfologi pada potongan jaringan. IHC tidak hanya dapat digunakan untuk mempelajari mekanisme penyakit, tetapi juga berperan penting dalam diagnosis kanker, pelokalan molekuler penanda, penelitian fungsi protein, dan sebagainya.

Prinsip Imunohistokimia

Bagian jaringan biasanya difiksasi dengan reagen kimia seperti formalin selama proses fiksasi, yang dapat menyebabkan epitop antigen menjadi kabur. Oleh karena itu, dalam percobaan IHC, pertama-tama perlu untuk mengekspos epitop antigen melalui perbaikan antigen (seperti perbaikan antigen yang diinduksi panas atau perbaikan yang diinduksi enzim). Melalui proses ini, molekul yang terikat silang dalam proses imobilisasi dapat dihilangkan, struktur tiga dimensi antigen dapat dipulihkan, dan pengikatan antibodi dapat difasilitasi. Inti dari percobaan imunohistokimia adalah reaksi antigen-antibodi. Dengan menerapkan antibodi primer spesifik (antibodi primer), ia dapat mengikat antigen target di bagian tersebut untuk membentuk kompleks antigen-antibodi. Untuk meningkatkan sinyal dan meningkatkan sensitivitas deteksi, antibodi sekunder (antibodi sekunder) digunakan dalam percobaan IHC. Antibodi sekunder adalah antibodi terhadap spesies turunan antibodi primer (seperti antibodi kelinci anti-tikus), dan penanda (seperti enzim atau pewarna fluoresen) biasanya dilekatkan pada antibodi sekunder. Melalui kombinasi antibodi sekunder dan antibodi primer, penanda dapat dilekatkan pada kompleks antigen-antibodi untuk memperkuat sinyal dan memfasilitasi deteksi selanjutnya. Penanda yang umum digunakan termasuk horseradish peroxidase (HRP) dan alkaline phosphatase (AP). Penanda pada antibodi sekunder menghasilkan sinyal yang terlihat melalui reaksi spesifik. Jika penanda adalah enzim, setelah antibodi sekunder terikat, enzim bereaksi dengan substrat yang sesuai untuk membentuk endapan atau reaksi warna, sehingga mengamati posisi penanda di bawah mikroskop. Reaksi substrat enzim yang umum adalah reaksi DAB (3,3'-diaminobenzidine), yang dapat menghasilkan endapan coklat dan dengan jelas menunjukkan lokasi antigen. Dalam beberapa kasus, penanda dapat berupa pewarna fluoresensi, yang kemudian diamati menggunakan mikroskop fluoresensi untuk menghasilkan sinyal fluoresensi pada panjang gelombang tertentu. Dalam percobaan IHC, pewarna nuklir seperti hematoksilin biasanya digunakan sebagai pewarnaan kontras untuk membedakan nukleus dari sitoplasma, sehingga dapat menentukan lokasi antigen dengan lebih jelas.

Tahapan Imunohistokimia

Persiapan Sampel

Sampel jaringan diambil, difiksasi dengan benar (seperti fiksasi formalin), lalu ditanamkan dalam parafin. Untuk membuat irisan jaringan, ketebalan umumnya adalah 4-6 mikron, dan irisan tersebut perlu diletakkan pada slide. Deparafinisasi dilakukan menggunakan xilena atau pelarut deparafin lainnya untuk menghilangkan lilin parafin, dan dicuci secara bertahap dengan etanol, lalu dicuci dengan air suling.

Perbaikan Antigen

Proses fiksasi dapat menutupi epitop beberapa antigen, sehingga diperlukan perbaikan antigen. Metode yang umum digunakan meliputi perbaikan antigen yang diinduksi panas (HIER) dan perbaikan yang diinduksi enzim. Metode HIER adalah dengan menempatkan irisan dalam buffer suhu tinggi (seperti buffer asam sitrat), dan mengaktifkan epitop antigen dengan suhu tinggi. Perbaikan yang diinduksi enzim (EIER) menggunakan enzim tertentu untuk menghilangkan masking antigen yang disebabkan oleh proses ikatan silang atau fiksasi dalam jaringan, sehingga memulihkan epitop antigen dan memungkinkannya untuk dikenali dan diikat oleh antibodi tertentu. Metode ini sangat cocok untuk antigen yang tidak dapat dipulihkan oleh perbaikan antigen yang diinduksi panas (HIER) tradisional, terutama beberapa penanda permukaan sel atau antigen yang lebih rapuh.

Memblokir Pengikatan Non-spesifik

Bagian tersebut diperlakukan dengan larutan pemblokiran (seperti larutan yang mengandung bovine serum albumin (BSA) atau serum kambing normal) untuk menghindari pengikatan antibodi sekunder yang tidak spesifik.

Inkubasi antibodi primer

Dengan menginkubasi antibodi primer spesifik dengan irisan, antibodi primer akan secara spesifik mengikat antigen target dalam irisan. Waktu dan suhu inkubasi perlu dioptimalkan sesuai dengan karakteristik antibodi primer.

Inkubasi Antibodi Sekunder

Setelah inkubasi dengan antibodi primer, antibodi sekunder yang sesuai dengan spesies antibodi primer digunakan untuk inkubasi, dan antibodi sekunder biasanya dikombinasikan dengan penanda (seperti enzim atau pewarna fluoresensi) untuk amplifikasi sinyal berikutnya.

Reaksi Warna

Metode pengembangan warna yang umum meliputi pengikatan HRP (horseradish peroxidase) ke substrat untuk membentuk produk warna, atau menggunakan antibodi sekunder berlabel fluoresensi untuk mikroskopi fluoresensi. Proses pewarnaan akan memperbesar pewarnaan posisi antigen, sehingga dapat dilihat.

Pewarnaan Kontras Nuklir

Hematoxylin biasanya digunakan untuk pewarnaan nuklir untuk membandingkan lokasi antigen dan inti di bawah mikroskop.

Penyegelan

Setelah pewarnaan, potongan-potongan tersebut ditutup dengan sealant untuk pengamatan mikroskopis. Pemilihan lem penyegel harus memastikan pengawetan hasil pewarnaan dalam jangka panjang.

Pengamatan dan Analisis Mikroskopis

Potongan jaringan yang telah diproses diamati dengan mikroskop untuk menganalisis lokasi, ekspresi, dan distribusi antigen. Berdasarkan intensitas pewarnaan dan morfologi jaringan, dikombinasikan dengan analisis kuantitatif (seperti perangkat lunak analisis gambar) untuk evaluasi lebih lanjut.

Gambar 1. Diagram yang menunjukkan mekanisme masing-masing platform mIHC/IF. (A) Sistem DISCOVERY ULTRA: setelah inkubasi antibodi primer, antibodi sekunder yang diberi label dengan HRP dimasukkan. HRP direaksikan dengan substrat yang sesuai yang terikat pada pewarna kromogenik, yang menghasilkan presipitasi endapan berwarna yang tidak larut di tempat antigen ditemukan. (B) Teknik IHC berbasis logam seperti IMC dan MIBI: antibodi primer yang terikat pada antigen target ditandai dengan isotop logam dengan massa molekul yang diketahui. Analisis dilakukan menggunakan spektrometri massa dalam MIBI dan ablasi laser yang digabungkan dengan sitometri massa dalam IMC. (C) Vectra: setelah inkubasi antibodi primer, antibodi sekunder yang diberi label dengan HRP dimasukkan. Molekul tiramid yang terkonjugasi fluorofor berfungsi sebagai substrat untuk HRP, yang menghasilkan sinyal fluoresensi yang terkait dengan antigen. (D) DSP Nanostring: antigen target akan mengikat antibodi primer yang digabungkan ke tag oligonukleotida yang dapat dibelah foto. Cahaya UV digunakan untuk membelah tag oligonukleotida dan dikumpulkan menggunakan tabung kapiler mikro dan disimpan dalam sumur mikroplat. Tag oligonukleotida akan mengikat probe reporter melalui probe penangkap spesifik target. Probe reporter dicitrakan dan dihitung oleh sistem analisis nCounter. Singkatan: mIHC/IF, imunohistokimia multipleks/imunofluoresensi; HRP, peroksidase lobak; IHC, imunohistokimia; IMC, Imaging Mass Cytometry; MIBI, Multiplexed Ion Beam Imaging; DSP, Digital Spatial Profiling. (Sumber referensi:Tinjauan umum teknik imunohistokimia/imunofluoresensi multipleks di era imunoterapi kanker.)

Keuntungan Imunohistokimia

Spesifisitas tinggi: Melalui spesifisitas reaksi antigen-antibodi, molekul target dapat diposisikan secara akurat di tingkat jaringan.

Informasi morfologi: IHC tidak hanya menyediakan informasi pada tingkat molekuler, tetapi juga menggabungkan karakteristik morfologi potongan histologis untuk menyediakan analisis lokalisasi tingkat jaringan atau sel.

Deteksi ganda: pewarnaan ganda dapat dilakukan dengan menggunakan antibodi yang berbeda dan menggabungkan penanda yang berbeda untuk mendeteksi ekspresi dan lokalisasi beberapa antigen.

Aplikasi Imunohistokimia

Diagnosa Kanker

IHC dapat membantu mengidentifikasi penanda molekuler spesifik dalam sel kanker untuk klasifikasi kanker, penentuan stadium dan evaluasi prognosis.

Penelitian Patologis

IHC digunakan dalam bidang patologi untuk menganalisis berbagai jenis jaringan dan sel untuk menilai karakteristik dan mekanisme penyakit tertentu.

Penelitian Imunologi

IHC dapat digunakan untuk mempelajari fungsi sistem imun dan interaksi antarsel. IHC dapat membantu mengidentifikasi subset sel imun tertentu, mengevaluasi respons imun dan hubungannya dengan penyakit.

Studi tentang Penanda Penyakit

Dengan memberi label antigen tertentu, IHC dapat membantu menemukan penanda penyakit baru. Misalnya, IHC dapat digunakan untuk mempelajari respons peradangan atau penanda molekuler dari infeksi bakteri dan virus tertentu.

Pengembangan Obat dan Uji Klinis

IHC digunakan untuk mengevaluasi efek obat baru pada sel atau jaringan selama pengembangan obat, terutama dengan mengamati perubahan ekspresi protein tertentu. Selain itu, IHC juga digunakan dalam uji klinis untuk memantau respons pasien terhadap obat.

Alpha Lifetech memastikan hasil yang berkualitas tinggi dan dapat direproduksi dengan mengoptimalkan setiap pengujian secara cermat untuk antibodi dan jenis jaringan tertentu yang digunakan. Mereka memenuhi berbagai kebutuhan penelitian, mulai dari sains dasar hingga studi translasi dan klinis. Komitmen Alpha Lifetech terhadap presisi dan keunggulan menjadikan mereka mitra tepercaya bagi para peneliti yang ingin meningkatkan pemahaman mereka tentang sistem biologis dan meningkatkan hasil perawatan kesehatan.

Tanya Jawab Umum

1. Pewarnaan non-spesifik sering terjadi pada percobaan IHC, yaitu, antibodi dapat mengikat molekul lain selain target, sehingga menyebabkan pewarnaan latar belakang terlalu kuat dan memengaruhi interpretasi hasil.

Solusi: (1) Kelompok kontrol yang sesuai digunakan: termasuk kontrol negatif (tidak ada antibodi primer atau sekunder yang ditambahkan) dan kontrol positif (jaringan yang diketahui mengekspresikan protein target) untuk mengonfirmasi spesifisitas pewarnaan. (2) Mengoptimalkan konsentrasi antibodi: Mengurangi konsentrasi antibodi terkadang dapat mengurangi pengikatan non-spesifik. Disarankan untuk menggunakan konsentrasi efektif minimum. (3) Latar belakang pemblokiran: Menggunakan agen pemblokiran yang sesuai (seperti serum normal, BSA, dll.), menyesuaikan konsentrasi agen pemblokiran, memblokir situs pengikatan non-spesifik pada bagian tersebut. (4) Memperbaiki langkah pencucian: Meningkatkan jumlah pencucian atau memperpanjang waktu untuk menghilangkan antibodi yang terikat secara tidak spesifik.
2. Protein target mungkin tidak terdeteksi dalam percobaan IHC. Hal ini mungkin disebabkan oleh sinyal pewarnaan terlalu lemah atau tidak ada sinyal sama sekali.

Solusi: (1) Periksa efektivitas antibodi: pastikan pengikatan antibodi ke protein target efektif dan memenuhi persyaratan eksperimen. Cobalah antibodi dari sumber yang berbeda. (2) Perpanjangan waktu inkubasi antibodi: Memperpanjang waktu inkubasi antibodi dengan tepat dapat meningkatkan sinyal. (3) Optimalkan konsentrasi antibodi: Terkadang mengurangi konsentrasi antibodi (terutama antibodi primer) membantu mengurangi pengikatan non-spesifik, sehingga meningkatkan intensitas sinyal. (4) Optimalkan langkah perbaikan antigen: Jika protein target tersembunyi di bagian jaringan karena proses fiksasi, menggunakan metode perbaikan antigen yang tepat dapat membantu memulihkan kemampuan deteksinya.
3. Kualitas potongan jaringan yang buruk (seperti terlalu tipis, terlalu tebal, kerusakan jaringan, dll.) dapat memengaruhi efek pewarnaan.

Solusi: (1) Optimalisasi ketebalan irisan: irisan jaringan berukuran 4-6μm biasanya direkomendasikan untuk eksperimen IHC. Irisan yang terlalu tipis dapat menghilangkan protein target, sedangkan irisan yang terlalu tebal dapat menyebabkan pewarnaan yang tidak merata. (2) Fiksasi jaringan yang benar: gunakan fiksatif yang tepat (seperti formalin 10%) dan pastikan jaringan terfiksasi sepenuhnya untuk menghindari atrofi atau deformasi jaringan. (3) Pengawetan jaringan: Pastikan irisan diawetkan dengan benar dan hindari degradasi atau denaturasi antigen karena pengawetan yang tidak tepat.
4. Antibodi dapat menyebabkan kegagalan pewarnaan karena afinitas yang tidak mencukupi, reaksi silang, dan alasan lainnya.

Solusi: (1) Pilih antibodi yang sesuai: pilih antibodi yang telah diverifikasi keefektifannya. Antibodi komersial dengan verifikasi yang memadai dapat dirujuk atau dibeli. (2) Gunakan antibodi sekunder dengan kualitas yang lebih tinggi: Kualitas antibodi sekunder sangat penting untuk peningkatan sinyal dan pengendalian pewarnaan latar belakang. Gunakan antibodi sekunder dengan afinitas tinggi dan latar belakang rendah. (3) Optimalisasi kondisi inkubasi: Pastikan suhu, waktu, dan kondisi buffer inkubasi antibodi memenuhi persyaratan petunjuk antibodi.

referensi

[1] Hussaini HM, Seo B, Rich AM. Imunohistokimia dan Imunofluoresensi. Metode Mol Biol. 2023;2588:439-450. doi:10.1007/978-1-0716-2780-8_26

[2] Ramos-Vara JA. Aspek teknis imunohistokimia. Vet Pathol. 2005;42(4):405-426. doi:10.1354/vp.42-4-405

[3] Tan WCC, Nerurkar SN, Cai HY, dkk. Tinjauan umum teknik imunohistokimia/imunofluoresensi multipleks di era imunoterapi kanker. Cancer Commun (London). 2020;40(4):135-153. doi:10.1002/cac2.12023

[4] Moreno V, Smith EA, Piña-Oviedo S. Imunohistokimia Fluoresens. Metode Mol Biol. 2022;2422:131-146. doi:10.1007/978-1-0716-1948-3_9

[5] Ortiz Hidalgo C. Imunohistokimia dalam Perspektif Sejarah: Mengetahui Masa Lalu untuk Memahami Masa Kini. Metode Mol Biol. 2022;2422:17-31. doi:10.1007/978-1-0716-1948-3_2