Protokol dan Pertanyaan yang Sering Diajukan (FAQ) tentang Imunohistokimia (IHC)

Imunohistokimia (IHC) adalah teknik yang banyak digunakan dalam biologi sel dan patologi. Teknik ini mewujudkan lokalisasi dan analisis kuantitatif protein, antigen, atau penanda molekuler spesifik dengan menggunakan ikatan spesifik antara antibodi dan antigen target serta menggabungkan analisis morfologi pada potongan jaringan. IHC tidak hanya dapat digunakan untuk mempelajari mekanisme penyakit, tetapi juga memainkan peran penting dalam diagnosis kanker, lokalisasi molekul penanda, penelitian fungsi protein, dan sebagainya.

Prinsip Imunohistokimia

Potongan jaringan biasanya difiksasi dengan reagen kimia seperti formalin selama proses fiksasi, yang dapat menyebabkan epitop antigen menjadi kabur. Oleh karena itu, dalam eksperimen IHC, pertama-tama perlu untuk mengekspos epitop antigen melalui perbaikan antigen (seperti perbaikan antigen yang diinduksi panas atau perbaikan yang diinduksi enzim). Melalui proses ini, molekul yang terikat silang dalam proses imobilisasi dapat dihilangkan, struktur tiga dimensi antigen dapat dipulihkan, dan pengikatan antibodi dapat difasilitasi. Inti dari eksperimen imunohistokimia adalah reaksi antigen-antibodi. Dengan menerapkan antibodi primer spesifik (antibodi primer), antibodi tersebut dapat mengikat antigen target dalam potongan jaringan untuk membentuk kompleks antigen-antibodi. Untuk meningkatkan sinyal dan meningkatkan sensitivitas deteksi, antibodi sekunder (antibodi sekunder) digunakan dalam eksperimen IHC. Antibodi sekunder adalah antibodi terhadap spesies turunan antibodi primer (seperti antibodi kelinci anti-tikus), dan penanda (seperti enzim atau pewarna fluoresen) biasanya dilekatkan pada antibodi sekunder. Melalui kombinasi antibodi sekunder dan antibodi primer, penanda dapat dilekatkan pada kompleks antigen-antibodi untuk memperkuat sinyal dan mempermudah deteksi selanjutnya. Penanda yang umum digunakan meliputi horseradish peroxidase (HRP) dan alkaline phosphatase (AP). Penanda pada antibodi sekunder menghasilkan sinyal yang terlihat melalui reaksi spesifik. Jika penanda berupa enzim, setelah antibodi sekunder berikatan, enzim bereaksi dengan substrat yang sesuai untuk membentuk endapan atau reaksi warna, sehingga posisi penanda dapat diamati di bawah mikroskop. Reaksi enzim-substrat yang umum adalah reaksi DAB (3,3'-diaminobenzidine), yang dapat menghasilkan endapan cokelat dan menunjukkan lokasi antigen dengan jelas. Dalam beberapa kasus, penanda dapat berupa pewarna fluoresen, yang kemudian diamati menggunakan mikroskop fluoresensi untuk menghasilkan sinyal fluoresensi pada panjang gelombang tertentu. Dalam percobaan IHC, pewarna inti seperti hematoksilin biasanya digunakan sebagai pewarnaan kontras untuk membedakan inti dari sitoplasma, sehingga lokasi antigen dapat ditentukan dengan lebih jelas.

Tahapan Imunohistokimia

Persiapan Sampel

Sampel jaringan diambil, difiksasi dengan benar (seperti fiksasi formalin), dan kemudian ditanamkan dalam parafin. Untuk membuat potongan jaringan, ketebalan umum adalah 4-6 mikron, dan potongan perlu ditempatkan pada slide. Deparafinisasi dilakukan menggunakan xylene atau pelarut deparafin lainnya untuk menghilangkan lilin parafin, dan secara bertahap dicuci dengan etanol, dan akhirnya dicuci dengan air suling.

Perbaikan Antigen

Proses fiksasi dapat menutupi epitop beberapa antigen, sehingga perbaikan antigen diperlukan. Metode yang umum digunakan meliputi perbaikan antigen yang diinduksi panas (HIER) dan perbaikan yang diinduksi enzim. Metode HIER adalah dengan menempatkan irisan jaringan dalam larutan penyangga bersuhu tinggi (seperti larutan penyangga asam sitrat), dan mengaktifkan epitop antigen dengan suhu tinggi. Perbaikan yang diinduksi enzim (EIER) menggunakan enzim spesifik untuk menghilangkan penutupan antigen yang disebabkan oleh proses pengikatan silang atau fiksasi pada jaringan, sehingga mengembalikan epitop antigen dan memungkinkannya untuk dikenali dan diikat oleh antibodi spesifik. Metode ini sangat cocok untuk antigen yang tidak dapat dipulihkan oleh perbaikan antigen yang diinduksi panas (HIER) tradisional, terutama beberapa penanda permukaan sel atau antigen yang lebih rapuh.

Memblokir Pengikatan Non-spesifik

Bagian-bagian tersebut diberi perlakuan dengan larutan penghambat (seperti larutan yang mengandung albumin serum sapi (BSA) atau serum kambing normal) untuk menghindari pengikatan non-spesifik antibodi sekunder.

Inkubasi antibodi primer

Dengan menginkubasi antibodi primer spesifik dengan irisan jaringan, antibodi primer akan secara spesifik berikatan dengan antigen target dalam irisan tersebut. Waktu dan suhu inkubasi perlu dioptimalkan sesuai dengan karakteristik antibodi primer.

Inkubasi Antibodi Sekunder

Setelah inkubasi dengan antibodi primer, antibodi sekunder yang sesuai dengan jenis antibodi primer digunakan untuk inkubasi, dan antibodi sekunder biasanya dikombinasikan dengan penanda (seperti enzim atau pewarna fluoresen) untuk amplifikasi sinyal selanjutnya.

Reaksi Warna

Metode pengembangan warna yang umum meliputi pengikatan HRP (horseradish peroxidase) ke substrat untuk membentuk produk warna, atau menggunakan antibodi sekunder berlabel fluoresen untuk mikroskop fluoresensi. Proses pewarnaan akan memperbesar pewarnaan pada posisi antigen, sehingga dapat terlihat.

Pewarnaan Kontras Nuklir

Hematoksilin biasanya digunakan untuk pewarnaan inti sel guna membandingkan lokasi antigen dan inti sel di bawah mikroskop.

Penyegelan

Setelah pewarnaan, bagian-bagian tersebut ditutup dengan perekat untuk pengamatan mikroskopis. Pemilihan lem perekat harus memastikan pengawetan hasil pewarnaan dalam jangka panjang.

Pengamatan dan Analisis Mikroskopis

Potongan jaringan yang telah diproses diamati dengan mikroskop untuk menganalisis lokasi, ekspresi, dan distribusi antigen. Berdasarkan intensitas pewarnaan dan morfologi jaringan, dikombinasikan dengan analisis kuantitatif (seperti perangkat lunak analisis gambar) untuk evaluasi lebih lanjut.

Gambar 1. Diagram yang menunjukkan mekanisme masing-masing platform mIHC/IF. (A) Sistem DISCOVERY ULTRA: setelah inkubasi antibodi primer, antibodi sekunder yang diberi label HRP dimasukkan. HRP direaksikan dengan substrat yang sesuai yang terikat pada pewarna kromogenik, yang menyebabkan pengendapan endapan berwarna yang tidak larut di tempat antigen ditemukan. (B) Teknik IHC berbasis logam seperti IMC dan MIBI: antibodi primer yang terikat pada antigen target diberi label dengan isotop logam dengan massa molekuler yang diketahui. Analisis dilakukan menggunakan spektrometri massa pada MIBI dan ablasi laser yang digabungkan dengan sitometri massa pada IMC. (C) Vectra: setelah inkubasi antibodi primer, antibodi sekunder yang diberi label HRP dimasukkan. Molekul tiramida yang dikonjugasikan dengan fluorofor berfungsi sebagai substrat untuk HRP, menghasilkan sinyal fluoresensi yang terkait dengan antigen. (D) DSP Nanostring: antigen target akan mengikat antibodi primer yang dihubungkan dengan tag oligonukleotida yang dapat terbelah oleh cahaya. Sinar UV digunakan untuk membelah tag oligonukleotida dan dikumpulkan menggunakan tabung mikrokapsul dan disimpan dalam sumur mikroplat. Tag oligonukleotida akan mengikat probe reporter melalui probe penangkap spesifik target. Probe reporter diimajinasikan dan dihitung oleh sistem analisis nCounter. Singkatan: mIHC/IF, imunohistokimia/imunofluoresensi multipleks; HRP, peroksidase lobak; IHC, imunohistokimia; IMC, Pencitraan Sitometri Massa; MIBI, Pencitraan Berkas Ion Multipleks; DSP, Pemprofilan Spasial Digital. (Sumber referensi: Gambaran umum teknik imunohistokimia/imunofluoresensi multipleks di era imunoterapi kanker..)

Keunggulan Imunohistokimia

Spesifisitas tinggi: Melalui spesifisitas reaksi antigen-antibodi, molekul target dapat diposisikan secara akurat pada tingkat jaringan.

Informasi morfologi: IHC tidak hanya memberikan informasi pada tingkat molekuler, tetapi juga menggabungkan karakteristik morfologi dari potongan histologis untuk memberikan analisis lokalisasi pada tingkat jaringan atau sel.

Deteksi ganda: pewarnaan ganda dapat dilakukan dengan menggunakan antibodi yang berbeda dan menggabungkan penanda yang berbeda untuk mendeteksi ekspresi dan lokalisasi beberapa antigen.

Penerapan Imunohistokimia

Diagnosis Kanker

IHC dapat membantu mengidentifikasi penanda molekuler spesifik dalam sel kanker untuk klasifikasi kanker, penentuan stadium, dan evaluasi prognosis.

Penelitian Patologis

IHC digunakan di bidang patologi untuk menganalisis berbagai jenis jaringan dan sel guna menilai karakteristik dan mekanisme penyakit tertentu.

Penelitian Imunologi

IHC dapat digunakan untuk mempelajari fungsi sistem kekebalan tubuh dan interaksi antar sel. Teknik ini dapat membantu mengidentifikasi subkelompok sel imun tertentu, mengevaluasi respons imun dan hubungannya dengan penyakit.

Studi tentang Penanda Penyakit

Dengan memberi label pada antigen spesifik, IHC dapat membantu menemukan penanda penyakit baru. Misalnya, dapat digunakan untuk mempelajari respons inflamasi atau penanda molekuler dari infeksi bakteri dan virus tertentu.

Pengembangan Obat dan Uji Klinis

IHC digunakan untuk mengevaluasi efek obat baru pada sel atau jaringan selama pengembangan obat, terutama dengan mengamati perubahan ekspresi protein tertentu. Selain itu, IHC juga digunakan dalam uji klinis untuk memantau respons pasien terhadap obat.

Alpha Lifetech memastikan hasil berkualitas tinggi dan dapat direproduksi dengan mengoptimalkan setiap pengujian secara cermat untuk antibodi dan jenis jaringan spesifik yang digunakan. Mereka melayani berbagai kebutuhan penelitian, mulai dari ilmu dasar hingga studi translasional dan klinis. Komitmen Alpha Lifetech terhadap presisi dan keunggulan menjadikan mereka mitra tepercaya bagi para peneliti yang ingin memajukan pemahaman mereka tentang sistem biologis dan meningkatkan hasil perawatan kesehatan.

Pertanyaan yang Sering Diajukan (FAQ)

1. Pewarnaan non-spesifik sering terjadi dalam eksperimen IHC, yaitu, antibodi dapat mengikat molekul lain selain target, sehingga menghasilkan pewarnaan latar belakang yang terlalu kuat dan memengaruhi interpretasi hasil.

Solusi: (1) Kelompok kontrol yang sesuai digunakan: termasuk kontrol negatif (tanpa penambahan antibodi primer atau sekunder) dan kontrol positif (jaringan yang diketahui mengekspresikan protein target) untuk mengkonfirmasi spesifisitas pewarnaan. (2) Mengoptimalkan konsentrasi antibodi: Mengurangi konsentrasi antibodi terkadang dapat mengurangi pengikatan non-spesifik. Dianjurkan untuk menggunakan konsentrasi efektif minimum. (3) Memblokir latar belakang: Menggunakan agen pemblokir yang sesuai (seperti serum normal, BSA, dll.), menyesuaikan konsentrasi agen pemblokir, memblokir situs pengikatan non-spesifik pada bagian tersebut. (4) Meningkatkan langkah pencucian: Meningkatkan jumlah pencucian atau memperpanjang waktu untuk menghilangkan antibodi yang terikat secara non-spesifik.
2. Protein target mungkin tidak terdeteksi dalam percobaan IHC. Hal ini mungkin disebabkan oleh sinyal pewarnaan yang terlalu lemah atau tidak ada sinyal sama sekali.

Solusi: (1) Periksa efektivitas antibodi: pastikan bahwa pengikatan antibodi ke protein target efektif dan memenuhi persyaratan eksperimen. Cobalah antibodi dari berbagai sumber. (2) Perpanjang waktu inkubasi antibodi: Memperpanjang waktu inkubasi antibodi secara tepat dapat meningkatkan sinyal. (3) Optimalkan konsentrasi antibodi: Terkadang mengurangi konsentrasi antibodi (terutama antibodi primer) membantu mengurangi pengikatan non-spesifik, sehingga meningkatkan intensitas sinyal. (4) Optimalkan langkah perbaikan antigen: Jika protein target tersembunyi dalam potongan jaringan karena proses fiksasi, menggunakan metode perbaikan antigen yang tepat dapat membantu mengembalikan deteksinya.
3. Kualitas potongan jaringan yang buruk (seperti terlalu tipis, terlalu tebal, kerusakan jaringan, dll.) dapat memengaruhi efek pewarnaan.

Solusi: (1) Optimalisasi ketebalan irisan: Irisan jaringan 4-6μm biasanya direkomendasikan untuk eksperimen IHC. Irisan yang terlalu tipis dapat menyebabkan hilangnya protein target, sedangkan irisan yang terlalu tebal dapat menyebabkan pewarnaan yang tidak merata. (2) Fiksasi jaringan yang benar: Gunakan fiksatif yang sesuai (seperti formalin 10%) dan pastikan jaringan terfiksasi sepenuhnya untuk menghindari atrofi atau deformasi jaringan. (3) Pengawetan jaringan: Pastikan irisan diawetkan dengan benar dan hindari degradasi atau denaturasi antigen akibat pengawetan yang tidak tepat.
4. Antibodi dapat menyebabkan kegagalan pewarnaan karena afinitas yang tidak mencukupi, reaksi silang, dan alasan lainnya.

Solusi: (1) Pilih antibodi yang tepat: pilih antibodi yang telah terverifikasi efektif. Antibodi komersial dengan verifikasi yang memadai dapat dijadikan referensi atau dibeli. (2) Gunakan antibodi sekunder berkualitas tinggi: Kualitas antibodi sekunder sangat penting untuk peningkatan sinyal dan pengendalian pewarnaan latar belakang. Gunakan antibodi sekunder dengan afinitas tinggi dan latar belakang rendah. (3) Optimalisasi kondisi inkubasi: Pastikan suhu, waktu, dan kondisi buffer inkubasi antibodi memenuhi persyaratan instruksi antibodi.

referensi

[1] Hussaini HM, Seo B, Rich AM. Imunohistokimia dan Imunofluoresensi. Metode Mol Biol. 2023;2588:439-450. doi:10.1007/978-1-0716-2780-8_26

[2] Ramos-Vara JA. Aspek teknis imunohistokimia. Vet Pathol. 2005;42(4):405-426. doi:10.1354/vp.42-4-405

[3] Tan WCC, Nerurkar SN, Cai HY, et al. Tinjauan teknik imunohistokimia/imunofluoresensi multipleks di era imunoterapi kanker. Cancer Commun (Lond). 2020;40(4):135-153. doi:10.1002/cac2.12023

[4] Moreno V, Smith EA, Piña-Oviedo S. Imunohistokimia Fluoresen. Metode Mol Biol. 2022;2422:131-146. doi:10.1007/978-1-0716-1948-3_9

[5] Ortiz Hidalgo C. Imunohistokimia dalam Perspektif Sejarah: Mengetahui Masa Lalu untuk Memahami Masa Kini. Metode Mol Biol. 2022;2422:17-31. doi:10.1007/978-1-0716-1948-3_2