Protokol Imunopresipitasi (IP) dan FAQ

Imunopresipitasi (IP) merupakan teknik eksperimental yang banyak digunakan dalam studi biologi dan biokimia. Teknik ini bertujuan untuk memperkaya dan memisahkan protein target atau kompleksnya dari campuran dengan antibodi spesifik. Teknologi IP biasanya digunakan untuk mempelajari interaksi antara protein, ekspresi protein, dan modifikasi protein.

Prinsip Imunopresipitasi

Ide inti dari imunopresipitasi adalah menggunakan pengikatan spesifik antibodi terhadap antigen target. Dalam percobaan, antibodi pertama-tama dicampur dengan lisat sel yang mengandung protein target atau sampel lain, dan antibodi akan mengikat protein target untuk membentuk kompleks. Selanjutnya, kompleks antibodi-protein dipisahkan dari larutan dengan menambahkan manik-manik agarosa protein A/G atau manik-manik magnetik yang sesuai. Kompleks yang dipisahkan dapat dicuci untuk menghilangkan zat pengikat yang tidak spesifik, dan akhirnya dideteksi dengan Western Blot dan teknik lainnya.

Tahapan Imunopresipitasi

Persiapan Sampel

Persiapan sampel merupakan langkah pertama dari percobaan imunopresipitasi. Berdasarkan kebutuhan percobaan, sampel dapat berupa lisat sel, ekstrak jaringan, atau media kultur. Selama proses persiapan, buffer lisis yang tepat biasanya digunakan untuk melepaskan protein dari sel atau jaringan. Pada saat ini, sampel mengandung protein target dan kemungkinan protein nontarget, asam nukleat, dan komponen lainnya.

Pengikatan Antibodi

Antibodi spesifik ditambahkan ke sampel. Antibodi biasanya menargetkan epitop spesifik dari protein target, sehingga dapat mengikat protein target secara efisien. Antibodi mengikat protein target untuk membentuk kompleks antibodi-protein, yang merupakan kunci untuk imunopresipitasi. Biasanya ada dua pilihan untuk jenis antibodi:

Antibodi monoklonal

Sangat spesifik dan mampu mengenali epitop spesifik dari protein target.

Antibodi poliklonal

Ia mengenali beberapa epitop protein target dan memiliki jangkauan pengenalan yang luas.

Penangkapan Kompleks Antibodi-Protein

Untuk memisahkan kompleks protein target-antibodi, protein A/G agarose beads atau magnetic beads sering digunakan sebagai pembawa dalam percobaan. Protein A/G dapat mengikat daerah Fc antibodi, sehingga dapat mengikat antibodi dengan mengikat antibodi. Setelah penambahan antibodi, kompleks protein-antibodi dapat ditangkap dengan dua cara berikut:

Sentrifugasi

Kompleks antibodi-protein dipisahkan dari sampel dengan sentrifugasi berkecepatan tinggi. Partikel (kompleks antibodi-protein) diendapkan di dasar tabung reaksi, sementara zat terlarut lainnya dibuang.

Pemisahan magnetik

Kompleks antibodi-protein diambil dari sampel menggunakan manik-manik magnetik. Manik-manik magnetik dipisahkan dari komposit oleh medan magnet eksternal.

Pencucian

Untuk menghilangkan pengotor yang tidak terikat dan molekul yang tidak terikat secara spesifik, diperlukan pencucian. Larutan pencuci (buffer yang mengandung garam) biasanya digunakan untuk beberapa kali pencucian. Proses ini membantu menghilangkan gangguan latar belakang dan meningkatkan spesifisitas percobaan. Komposisi larutan pencuci dapat dioptimalkan sesuai kebutuhan untuk memastikan bahwa pengotor berlebih dihilangkan tanpa memengaruhi kompleks protein target.

Elusi Protein Target

Setelah protein target berhasil diperkaya, langkah elusi diikuti untuk memisahkan protein target dari kompleks antibodi. Metode elusi umum meliputi:

Elusi antigen kompetitif

Disosiasi kompetitif kompleks antibodi-protein menggunakan antigen yang sama atau serupa (biasanya peptida tertentu dari protein target) sebagai protein target.

Mengubah pH Elusi

Gunakan buffer pH rendah atau pH tinggi untuk mengganggu pengikatan antara antibodi dan protein target, sehingga mengeluarkan protein target.

Setelah elusi, protein target dapat dianalisis dengan SDS-PAGE, Western Blot dan teknik lainnya.

Analisis dan Deteksi

Protein target setelah elusi dapat dikenai serangkaian analisis. Metode yang umum digunakan meliputi:

SDS-HALAMAN

Protein dipisahkan dengan elektroforesis menurut berat molekulnya, kemudian kemurnian dan berat molekulnya dianalisis.

Penyakit Western Blot

Digunakan untuk mendeteksi keberadaan dan ekspresi protein tertentu, dan untuk mengidentifikasi protein target dengan antibodi berlabel.

Spektrometri massa

Untuk identifikasi dan kuantifikasi lebih lanjut dari protein target.

Gambar 1. Representasi skematis dari tahapan protokol imunopresipitasi yang disajikan dalam Protokol Dasar 1. (1) Lisis sel: antigen dilarutkan dengan ekstraksi sel dengan atau tanpa deterjen. Untuk meningkatkan spesifisitas, lisat sel dapat dibersihkan terlebih dahulu dengan manik-manik protein A–agarosa (langkah 15 hingga 17, tidak ditampilkan). (2) Imobilisasi antibodi: antibodi spesifik diikatkan pada manik-manik protein A–agarosa. (3) Penangkapan antigen: antigen yang dilarutkan diisolasi pada manik-manik yang terkonjugasi antibodi. (Sumber referensi:Imunopresipitasi. doi:10.1002/0471140864.ps0908s18)

Aplikasi imunopresipitasi

Studi Interaksi Protein-Protein

Dengan imunopresipitasi, protein lain yang berinteraksi dengan protein target dapat ditangkap.

Pengayaan dan Analisis Kompleks Protein

Digunakan untuk menganalisis komposisi dan fungsi kompleks protein.

Deteksi Epitop Antigenik

Teknologi IP dapat mengidentifikasi pengikatan antibodi terhadap antigen tertentu.

Penelitian Modifikasi Protein

Untuk mempelajari fosforilasi protein, asetilasi dan modifikasi lainnya.

Alpha Lifetech memiliki pengalaman bertahun-tahun dalam proyek dan dapat melayani kebutuhan pelanggan dengan lebih baik. Alpha Lifetech menyediakan layanan imunopresipitasi (IP) dengan spesifisitas dan sensitivitas tinggi untuk memastikan ekstraksi dan analisis protein target yang efisien dari berbagai sampel biologis.

Tanya Jawab Umum

1. Dalam percobaan imunopresipitasi, jika protein target terkontaminasi oleh protein pengikat non-spesifik, hal itu akan menyebabkan sinyal latar belakang yang tinggi atau hasil spesifisitas yang rendah. Sinyal latar belakang yang tinggi akan memengaruhi analisis hasil percobaan dan mengurangi kemampuan deteksi protein target.

Solusi: (1) Optimalkan pemilihan antibodi: Pilih antibodi monoklonal yang sangat spesifik atau antibodi yang tervalidasi. Pastikan antibodi menargetkan satu-satunya epitop dari protein target dan hindari reaksi silang dengan protein non-target. (2) Gunakan buffer pencuci yang sesuai: tingkatkan jumlah langkah pencucian, dan gunakan buffer garam tinggi untuk menghilangkan molekul pengikat non-spesifik. Komposisi larutan pencuci harus dioptimalkan sesuai dengan karakteristik antibodi dan protein target. (3) Penggunaan agen penghambat: Penghambat (seperti BSA atau bovine serum albumin) dapat digunakan untuk memblokir kemungkinan tempat pengikatan non-spesifik sebelum pengikatan antibodi untuk mengurangi latar belakang.
2. Kadang-kadang percobaan tidak dapat memperoleh presipitasi protein target yang diharapkan, mungkin karena protein target tidak sepenuhnya bergabung dengan antibodi, atau afinitas antibodi rendah, sehingga mengakibatkan protein target tidak diperkaya secara efektif.

Solusi: (1) Optimalkan konsentrasi antibodi: Pastikan konsentrasi antibodi yang digunakan sesuai. Konsentrasi antibodi yang terlalu rendah dapat menyebabkan pengikatan yang tidak memadai, dan konsentrasi yang terlalu tinggi dapat menyebabkan pengikatan yang tidak spesifik. (2) Meningkatkan waktu inkubasi dan suhu: Memperpanjang waktu inkubasi antibodi dan sampel, biasanya inkubasi semalaman pada suhu 4 ° C dapat meningkatkan efisiensi pengikatan. (3) Gunakan manik-manik pembawa protein A / G yang sesuai: Pilih manik-manik pembawa yang sesuai (seperti protein A, protein G, manik-manik magnetik) dan pastikan bahwa manik-manik dapat secara efektif mengikat antibodi. (4) Optimalisasi lisis sel: Pastikan bahwa buffer lisis sel yang sesuai digunakan, dan optimalkan kondisi lisis (seperti nilai pH larutan lisis, konsentrasi garam, dll.) Sesuai dengan sifat-sifat protein target.
3. Protein target dapat terdegradasi selama imunopresipitasi, sehingga tidak dapat memperoleh hasil presipitasi yang efektif. Hal ini biasanya disebabkan oleh adanya protease dalam sampel, atau kondisi pembelahan tidak sesuai untuk menstabilkan protein.

Solusi : (1) Penambahan inhibitor protease : Inhibitor protease (seperti PMSF, EDTA, campuran inhibitor protease, dll.) ditambahkan ke lisat untuk mencegah degradasi protein. (2) Optimalkan kondisi lisis : gunakan buffer lisis yang tepat untuk menghindari gangguan sel yang berlebihan atau kerusakan pada struktur protein target. (3) Operasi suhu rendah : Cobalah untuk mempertahankan operasi suhu rendah di semua langkah untuk mengurangi risiko degradasi protein.
4. Protein target yang diendapkan tidak lengkap, dan beberapa protein target mungkin tertinggal dalam supernatan, sehingga menghasilkan sejumlah kecil protein target yang dipulihkan.

Solusi: (1) Optimalkan kecepatan dan waktu sentrifugasi: pastikan bahwa kondisi sentrifugasi dapat mengendapkan kompleks antibodi-protein secara menyeluruh. Untuk partikel yang lebih kecil, mungkin perlu menambah waktu sentrifugasi atau menambah kecepatan sentrifugasi. (2) Menggunakan Manik Magnetik: Menggunakan manik magnetik dapat menangkap kompleks antibodi-protein secara lebih efisien dan mengurangi kerugian. (3) Tingkatkan proporsi manik antibodi dan pembawa: tingkatkan jumlah manik antibodi dan pembawa secara tepat untuk meningkatkan efisiensi penangkapan.
5. Pada hasil imunopresipitasi, kemungkinan terdapat sejumlah besar pengotor protein nontarget, sehingga mengakibatkan kemurnian protein target tidak tinggi, sehingga mempengaruhi analisis selanjutnya (seperti Western Blot).

Solusi: (1) Pencucian berulang: Gunakan larutan pencuci yang sesuai dan lakukan pencucian berulang untuk menghilangkan protein yang tidak terikat secara spesifik. Konsentrasi garam dalam larutan pencuci dapat ditingkatkan secara tepat untuk membantu menghilangkan beberapa molekul pengikat yang tidak spesifik. (2) Skema pencucian yang berbeda digunakan: terkadang sesuai dengan sifat protein target, komposisi larutan pencuci dapat diubah, seperti meningkatkan konsentrasi deterjen (seperti Triton X-100) untuk membantu menghilangkan protein membran atau protein lain yang tidak diinginkan. (3) Pilih antibodi dan manik pembawa yang sesuai: Gunakan antibodi dan manik pembawa yang sesuai untuk protein target untuk memastikan bahwa mereka memiliki afinitas tinggi terhadap protein target dan mengurangi gangguan pengotor.

referensi

[1] DeCaprio J, Kohl TO. Imunopresipitasi. Protokol Cold Spring Harb. 2017;2017(12):pdb.prot098640. Diterbitkan 1 Desember 2017. doi:10.1101/pdb.prot098640

[2] Bonifacino JS, Dell'Angelica EC, Springer TA. Imunopresipitasi. Curr Protoc Protein Sci. 2001;Bab 9:. doi:10.1002/0471140864.ps0908s18

[3] Wang L, Sanchez J, Hess D, Matthias P. Imunopresipitasi HDAC6 dan Protein yang Berinteraksi. Metode Mol Biol. 2023;2589:493-508. doi:10.1007/978-1-0716-2788-4_32

[4] Mohammed H, Taylor C, Brown GD, Papachristou EK, Carroll JS, D'Santos CS. Spektrometri massa imunopresipitasi cepat protein endogen (RIME) untuk analisis kompleks kromatin. Nat Protoc. 2016;11(2):316-326. doi:10.1038/nprot.2016.020

[5] Sanz LA, Chédin F. Pemetaan R-loop spesifik untai beresolusi tinggi melalui imunopresipitasi DNA-RNA berbasis S9.6 dan pengurutan throughput tinggi. Nat Protoc. 2019;14(6):1734-1755. doi:10.1038/s41596-019-0159-1