Layanan Konstruksi Perpustakaan Phage Display

Alpha Lifetech telah berkecimpung dalam teknologi Phage Display selama bertahun-tahun. Perusahaan ini telah membangun platform teknologi Phage Display yang stabil dan sempurna yang menghemat waktu untuk penelitian ilmiah atau penelitian proyek dan memfasilitasi produksi selanjutnya. Alpha Lifetech juga dapat menyediakan layanan kepada pelanggan seperti produksi antibodi vhh, produksi antibodi scFv, dan produksi antibodi Fab.

Alpha Lifetech memiliki platform tampilan fage M13/T7 yang komprehensif untuk memastikan konstruksi dan produksi pustaka antibodi. Kami juga dapat menyediakan layanan yang disesuaikan, seperti produksi antibodi scFv dan penyaringan antibodi berkecepatan tinggi, untuk memenuhi kebutuhan Anda.

Pengantar tentang tampilan fage

Teknologi tampilan fage (phage display) adalah teknik yang menggunakan fage (virus yang menginfeksi bakteri) untuk mencari molekul pengikat fungsional dari protein atau peptida spesifik. Teknik pembuatan pustaka antibodi fage meliputi pembuatan pustaka antibodi Fab, pembuatan pustaka antibodi scFv, pembuatan pustaka nanobody, dan lain-lain. Menurut jenis bakteriofage, dapat dibagi menjadi M13, T7, T4, λ, dan sistem lainnya. Menurut jenis pustaka, dapat dibagi menjadi pustaka peptida acak, pustaka cDNA, pustaka antibodi, dan pustaka protein. Teknologi tampilan fage mudah dioperasikan dan murah untuk digunakan. Namun, teknik ini membatasi keragaman genetika molekuler dalam pustaka yang tidak dapat mengekspresikan sekuens yang terlalu panjang.

Saat ini, teknologi phage display banyak digunakan. Di antaranya, terdapat pencapaian signifikan dalam penelitian dan pengembangan vaksin baru (vaksin sintetis berbiaya rendah dan efisien), pengembangan obat antibodi (penyaringan penghambat enzim), transduksi sinyal sel (penyaringan epitop simulasi), dan penelitian epitop antigen (pembuatan antibodi monoklonal).

Pengantar Bakteriofag T7

Bakteriofag T7 adalah DNA untai ganda, dengan panjang DNA 40 kb dan terbungkus dalam kapsid berdiameter 60 nm. Penghubung antara kepala dan ekor adalah struktur cincin yang terdiri dari beberapa salinan gp8. Kepala dan inti bakteriofag T7 membentuk struktur silindris yang mengikat gp8 dan dapat menghubungkan kepala dan ekor.

Gambar 1. Representasi skematis dari bakteriofag T7.(Referensi: Kemajuan dalam sistem tampilan fage T7 (Ulasan))

Pengantar Bakteriofag M13

Bakteriofag M13 termasuk dalam kelompok fag filamen yang secara kolektif disebut fag Ff. Panjangnya 900 nm dan lebarnya 6,5 nm. Ia memiliki genom DNA untai tunggal (ssDNA) dengan panjang 6407 bp yang terdiri dari sembilan gen yang mengkode 11 protein berbeda. Di antaranya, lima protein merupakan protein selubung, dan enam protein lainnya terlibat dalam replikasi dan perakitan fag. Konsentrasi protein selubung tertinggi terdapat pada protein kapsid G8P, yang terdiri dari sekitar 2.700 unit protein dan membentuk selubung di sekitar kromosom.

Gambar 2. Representasi skematis dari bakteriofag M13.(Referensi: Dasar-dasar Teknologi Phage Display Antibodi)

Pengantar Perpustakaan Antibodi Phage Display

Penemuan antibodi menjadi semakin penting dalam kedokteran modern. Terdapat berbagai pendekatan penemuan antibodi, tetapi pustaka antibodi tampilan fage (phage display antibody library) lebih banyak digunakan dalam ilmu kedokteran.

Sejak tahun 1990, berbagai format antibodi telah digunakan untuk membangun pustaka fage, termasuk VH, VHH, scFv, diabodi, dan antibodi Fab. scFv yang terdiri dari domain struktural VH dan VL adalah antibodi rantai tunggal yang digunakan untuk membangun pustaka antibodi scFv. scFv dicirikan oleh waktu paruh yang pendek dan imunogenisitas yang rendah. Pustaka Antibodi Fab terdiri dari VH, VL, CL, dan CH1, yang dapat dengan cepat menyaring antibodi ideal dengan afinitas tinggi. Unit terkecil yang dapat mengikat antigen target—VHH—merupakan pustaka nanobodi. Saat ini, VHH memiliki keunggulan struktur sederhana, volume kecil, kelarutan tinggi, stabilitas yang baik, serta persiapan dan ekspresi yang mudah. Pustaka nanobodi sintetis (Nb) muncul sebagai alternatif yang menarik untuk imunisasi hewan karena nanobodi sintetis yang stabil dan berafinitas tinggi. Secara umum, fragmen antibodi ini digabungkan dengan G3P dari fage M13, dan dengan mengkloning sejumlah besar gen yang mengkode fragmen antibodi, pustaka antibodi tampilan fage yang besar dapat dihasilkan dari mana banyak antibodi yang beragam dapat dipilih.

Proses Konstruksi Perpustakaan Fag

Proses pembuatan pustaka fage adalah sebagai berikut: primer spesifik dirancang untuk amplifikasi PCR yang menghasilkan produk, yang kemudian diikat secara enzimatik dengan vektor fage T7/M13, dan plasmid fage rekombinan berhasil dibuat. Plasmid fage rekombinan ditransformasikan ke dalam sel reseptor TG1, kemudian dilapisi pada media yang mengandung antibiotik yang sesuai, dan kultur diperbanyak setelah penyaringan transformator. Setelah beberapa putaran kultur, fage bereplikasi beberapa kali dalam bakteri dan berhasil mengekspresikan protein atau polipeptida target. Kemudian pustaka fage dimurnikan untuk menghilangkan beberapa pengotor dan fage yang tidak terikat.

Daerah variabel (VH dan VL) berkorelasi dengan keragaman antibodi, dan VH serta VL dimasukkan ke dalam vektor fage bersama dengan sekuens yang mengkode protein fage PIII. Setelah perakitan, partikel fage diekspos dan difusikan dengan N-terminal protein selubung minor III untuk membentuk fragmen antibodi fungsional, sehingga diperoleh pustaka yang berisi sekuens DNA antibodi.

Setelah imunisasi selesai, titer dideteksi, dan darah hewan diambil setelah titer memenuhi syarat. Limfosit diisolasi dari darah, RNA diekstraksi, RT-PCR memperkuat fragmen target, dan fragmen gen daerah V diperoleh. Gen V diperkuat menggunakan primer spesifik.

Pustaka alami yang dibuat mencakup antibodi imunogenik lemah pada hewan yang dapat menargetkan target apa pun. Antibodi fage yang mengikat secara spesifik pada antigen dapat dikumpulkan menggunakan teknik penyaringan yang memfiksasi atau memberi label pada antigen.

Antigen target diikatkan pada pembawa padat, seperti lubang mikropelat, atau dihubungkan ke manik magnetik. Pustaka antibodi fage kemudian ditambahkan untuk mengikatnya ke antigen. Setelah beberapa kali elusi, fage dengan afinitas rendah atau non-spesifik akan tercuci dan fage yang menampilkan antibodi spesifik akan dipertahankan.

Penerapan Phage Display

*Penemuan antibodi menjadi semakin penting dalam kedokteran modern. Berbagai pendekatan penemuan antibodi ada, tetapi teknologi tampilan fage lebih banyak digunakan dalam ilmu kedokteran. Sejak tahun 1990, berbagai format antibodi telah digunakan untuk membangun pustaka fage, termasuk VH, VHH, scFv, diabodi, dan antibodi Fab.
*Pustaka peptida fage memungkinkan penentuan urutan epitop protein secara cepat dan telah menjadi alat yang ampuh untuk menyelidiki interaksi antara epitop dan reseptor antigen.
*Fragmen antibodi digabungkan ke G3P dari fage M13, dan dengan mengkloning sejumlah besar gen yang mengkode fragmen antibodi, pustaka antibodi tampilan fage yang besar dapat dihasilkan dari mana banyak antibodi yang beragam dapat dipilih.
*Sistem tampilan fage T7 memiliki banyak keunggulan, termasuk kesederhanaan, keamanan tinggi, stabilitas, kemudahan penyimpanan, dan transportasi, sehingga sistem ini digunakan dalam vaksin pencegahan dan pengobatan.
*Sistem tampilan fage T7 dapat mendeteksi berbagai antigen, seperti antigen permukaan mikroorganisme patogen dan antigen kanker.

Fag