Layanan Konstruksi Perpustakaan Tampilan Phage

Alpha Lifetech telah terlibat secara mendalam dalam teknologi tampilan Phage selama bertahun-tahun. Perusahaan ini telah membangun platform teknologi tampilan Phage yang sangat stabil yang menghemat waktu untuk penelitian ilmiah atau penelitian proyek dan memfasilitasi produksi selanjutnya. Alpha Lifetech juga dapat menyediakan layanan kepada pelanggan seperti produksi antibodi vhh, produksi antibodi scFv, produksi antibodi Fab.

Alpha Lifetech memiliki platform tampilan fag M13/T7 yang komprehensif untuk memastikan konstruksi dan produksi pustaka antibodi. Kami juga dapat menyediakan layanan yang disesuaikan, seperti produksi antibodi scFv dan penyaringan antibodi berthroughput tinggi, untuk memenuhi kebutuhan Anda.

Pengantar tampilan Fage

Teknologi tampilan fag adalah teknik yang menggunakan fag (virus yang menginfeksi bakteri) untuk mencari molekul pengikat fungsional protein atau peptida tertentu. Teknik konstruksi pustaka antibodi fag meliputi konstruksi pustaka antibodi Fab, konstruksi pustaka antibodi scFv, konstruksi pustaka nanobodi, dll. Menurut jenis bakteriofag, mereka dapat dibagi menjadi sistem M13, T7, T4, λ, dan lainnya. Menurut jenis pustaka, dapat dibagi menjadi pustaka peptida acak, pustaka cDNA, pustaka antibodi, dan pustaka protein. Teknologi tampilan fag mudah dioperasikan dan murah untuk digunakan. Namun, teknik ini membatasi keragaman genetika molekuler di pustaka yang tidak dapat mengekspresikan urutan yang terlalu panjang,

Saat ini, teknologi tampilan fag banyak digunakan. Di antaranya, terdapat pencapaian signifikan dalam penelitian dan pengembangan vaksin baru (vaksin sintetis berbiaya rendah dan efisien), pengembangan obat antibodi (penghambat enzim penyaringan), transduksi sinyal sel (penyaringan epitop simulasi), dan penelitian epitop antigen (persiapan antibodi monoklonal).

Pengantar Bakteriofag T7

Bakteriofag T7 adalah DNA untai ganda, panjang DNA adalah 40kb dan dibungkus dalam kapsid dengan diameter 60nm. Konektor antara kepala dan ekor adalah struktur cincin yang terdiri dari beberapa salinan gp8. Kepala dan inti bakteriofag T7 membentuk struktur silinder yang mengikat gp8 dan dapat menghubungkan kepala dan ekor.

Gambar 1 Representasi skema bakteriofag T7.(Referensi:Kemajuan dalam sistem tampilan fag T7 (Ulasan))

Pengantar Bakteriofag M13

Bakteriofag M13 termasuk dalam kelompok fag berfilamen yang secara kolektif disebut fag Ff. Bakteriofag ini memiliki panjang 900 nm dan lebar 6,5 nm. Bakteriofag ini mengandung genom DNA untai tunggal (ssDNA) dengan panjang 6407 bp yang terdiri dari sembilan gen yang mengkode 11 protein berbeda. Di antara semuanya, lima protein adalah protein pelapis, dan enam protein terlibat dalam replikasi dan perakitan fag. Konsentrasi protein pelapis tertinggi adalah protein kapsid G8P, yang terdiri dari sekitar 2.700 unit protein dan membentuk selubung di sekitar kromosom.

Gambar 2 Representasi skema bakteriofag M13.(Referensi:Dasar-dasar Teknologi Tampilan Fag Antibodi)

Pengantar Perpustakaan Antibodi Tampilan Fage

Penemuan antibodi menjadi semakin penting dalam pengobatan modern. Ada berbagai pendekatan penemuan antibodi, tetapi pustaka antibodi tampilan fag lebih banyak digunakan dalam ilmu kedokteran.

Sejak tahun 1990, berbagai format antibodi telah digunakan untuk membangun perpustakaan fag, termasuk VH, VHH, scFv, diabodi, dan antibodi Fab. ScFv yang terdiri dari domain struktural VH dan VL adalah antibodi rantai tunggal yang digunakan untuk membangun perpustakaan antibodi scFv. ScFv dicirikan oleh waktu paruh yang pendek dan imunogenisitas yang rendah. Perpustakaan Antibodi Fab terdiri dari VH, VL, CL, dan CH1, yang dapat dengan cepat menyaring antibodi ideal dengan afinitas tinggi. Unit terkecil yang dapat mengikat antigen target-VHH merupakan perpustakaan nanobodi saat ini, VHH memiliki keunggulan struktur sederhana, volume kecil, kelarutan tinggi, stabilitas yang baik, dan persiapan serta ekspresi yang mudah. Perpustakaan nanobodi sintetis (Nb) muncul sebagai alternatif yang menarik untuk imunisasi hewan untuk nanobodi sintetis yang stabil dan berafinitas tinggi. Secara umum, fragmen antibodi ini dipadukan dengan G3P dari fag M13, dan dengan mengkloning sejumlah besar gen yang mengkodekan fragmen antibodi, pustaka antibodi tampilan fag yang besar dapat dihasilkan dari mana banyak antibodi yang beragam dapat dipilih.

Proses Konstruksi Perpustakaan Phage

Proses pembuatan pustaka fag adalah sebagai berikut: primer spesifik dirancang untuk amplifikasi PCR yang memperoleh produk, yang diligasi enzim dengan vektor fag T7/M13, dan plasmid fag rekombinan berhasil dibuat. Plasmid fag rekombinan ditransformasikan ke dalam sel reseptor TG1, kemudian dilapisi pada media yang mengandung antibiotik yang sesuai, dan kultur yang diperluas dilakukan setelah penyaringan transformator. Setelah beberapa putaran kultur, fag mereplikasi waktu replikasi dalam bakteri dan berhasil mengekspresikan protein atau polipeptida target. Kemudian pustaka fag dimurnikan untuk menghilangkan beberapa pengotor dan fag yang tidak terikat.

Daerah variabel (VH dan VL) berkorelasi dengan keragaman antibodi, dan VH dan VL dimasukkan ke dalam vektor fag bersama dengan urutan yang mengkode protein fag PIII. Setelah perakitan, partikel fag diekspos dan dilebur dengan N-terminal protein lapisan minor III untuk membentuk fragmen antibodi fungsional, sehingga diperoleh pustaka yang berisi urutan DNA antibodi.

Setelah imunisasi selesai, titer dideteksi, dan darah hewan diambil setelah titer memenuhi syarat. Limfosit diisolasi dari darah, RNA diekstraksi, RT-PCR mengamplifikasi fragmen target, dan fragmen gen wilayah V diperoleh. Gen V diamplifikasi menggunakan primer spesifik.

Pustaka alami yang dibuat mencakup antibodi imunogenik yang buruk pada hewan yang dapat menargetkan target apa pun. Antibodi fag yang mengikat antigen secara spesifik dapat dikumpulkan menggunakan teknik penyaringan yang memperbaiki atau memberi label pada antigen.

Antigen target difiksasi ke pembawa padat, seperti lubang mikroplat, atau disambungkan ke manik magnetik. Pustaka antibodi fag kemudian ditambahkan untuk mengikatnya ke antigen. Setelah beberapa kali elusi, fag berafinitas rendah atau nonspesifik akan hilang dan fag yang menampilkan antibodi spesifik akan dipertahankan.

Aplikasi Tampilan Fag

*Penemuan antibodi telah menjadi semakin penting dalam pengobatan modern. Berbagai pendekatan penemuan antibodi telah ada, tetapi teknologi tampilan fag lebih banyak digunakan dalam ilmu kedokteran. Sejak tahun 1990, berbagai format antibodi telah digunakan untuk membangun perpustakaan fag, termasuk VH, VHH, scFv, diabodi, dan antibodi Fab.
*Perpustakaan peptida fag memungkinkan penentuan cepat urutan epitop protein dan telah menjadi alat yang ampuh untuk menyelidiki interaksi antara epitop dan reseptor antigen.
*Fragmen antibodi dipadukan dengan G3P dari fag M13, dan dengan mengkloning sejumlah besar gen yang mengkodekan fragmen antibodi, pustaka antibodi tampilan fag yang besar dapat dihasilkan dari mana banyak antibodi yang beragam dapat dipilih.
*Sistem tampilan fag T7 memiliki banyak keunggulan, termasuk kesederhanaan, keamanan tinggi, stabilitas, penyimpanan mudah, dan transportasi, sehingga sistem ini digunakan dalam vaksin pencegahan dan terapeutik.
*Sistem tampilan fag T7 dapat mendeteksi berbagai antigen, seperti antigen permukaan mikroorganisme patogen dan antigen kanker.

Fag