Protokol Western Blotting dan Pertanyaan yang Sering Diajukan

Western blotting adalah teknik yang banyak digunakan baik dalam penelitian ilmiah maupun diagnostik klinis, yang menyediakan metode yang andal untuk menganalisis protein dalam campuran kompleks. Teknik ini terutama digunakan untuk mendeteksi protein spesifik, serta menentukan kelimpahan relatifnya dalam berbagai sampel. Dengan menggunakan antibodi spesifik yang mengikat protein target, Western blotting memungkinkan identifikasi dan kuantifikasi protein yang diinginkan dalam sampel heterogen. Teknik ini sangat berharga dalam studi proses pemurnian protein, memungkinkan peneliti untuk menilai kemurnian dan keberadaan protein pada berbagai tahap pemurnian. Selain itu, Western blotting memainkan peran penting dalam mengevaluasi tingkat ekspresi protein dalam sel di bawah kondisi eksperimental yang berbeda, seperti sebagai respons terhadap obat, stres, atau penyakit. Fleksibilitasnya telah menjadikannya landasan di banyak bidang, termasuk biologi sel, biologi molekuler, biokimia, dan diagnostik klinis, di mana teknik ini digunakan untuk menyelidiki mekanisme molekuler yang mendasari penyakit, termasuk kanker, gangguan neurodegeneratif, dan kondisi terkait imun.

Sejarah Western blotting dimulai pada tahun 1979, ketika ahli biologi Inggris Alistair J. Towbin dan rekan-rekannya pertama kali mengusulkan dan menerapkan metode ini dalam penelitian mereka. Towbin dkk. awalnya menggunakan elektroforesis untuk memisahkan protein dan mentransfernya melalui membran polietilen, kemudian melakukan deteksi spesifik melalui antibodi. Metode ini telah banyak digunakan dalam penelitian biologi sel dan biologi molekuler, dan telah menjadi salah satu teknik standar emas untuk analisis protein.

Prinsip Western Blotting

Pemisahan Protein

Pertama, protein dalam sampel dipisahkan dengan elektroforesis gel (biasanya SDS-PAGE, elektroforesis gel poliakrilamida) berdasarkan ukuran molekulnya.

Transfer Protein

Protein yang telah dipisahkan kemudian dipindahkan melalui elektroforesis ke penyangga padat, biasanya membran polivinilidena fluorida (PVDF) atau membran nitroselulosa.

Deteksi Antibodi

Pada membran yang ditransfer, antibodi spesifik digunakan untuk mengenali protein target. Antibodi ini biasanya diberi label (seperti pelabelan enzim) dan dapat menghasilkan sinyal yang terukur (seperti kemiluminesensi).

Deteksi Sinyal

Sinyal reaksi antibodi-antigen diperoleh melalui sistem deteksi yang sesuai (seperti perangkat pencitraan kemiluminesensi) untuk mencapai analisis kualitatif dan kuantitatif protein target.

Reagen dan Instrumen yang dibutuhkan

1Larutan penyangga elektroforesis: digunakan untuk pemisahan protein dalam gel SDS-PAGE dan sistem elektroforesis.
2 Larutan pemblokir: seperti susu bubuk skim atau BSA, untuk mencegah pengikatan antibodi non-spesifik.
3 Antibodi primer dan antibodi sekunder: Antibodi primer adalah antibodi spesifik terhadap protein target, dan antibodi sekunder umumnya adalah antibodi berlabel enzim yang terikat pada antibodi primer.
4 Larutan substrat: seperti substrat kemiluminesensi atau substrat kolorimetri, digunakan untuk deteksi sinyal antibodi berlabel.
5 Kalibrator protein: Standar protein seperti ukuran yang telah ditentukan digunakan untuk mengkonfirmasi berat molekul protein dalam sampel.
6 Sistem elektroforesis gel SDS-PAGE: untuk pemisahan protein.
7 Sistem transmembran: digunakan untuk transfer protein dari gel ke membran.
8Sistem pencitraan kemiluminesensi: digunakan untuk mendeteksi sinyal setelah reaksi antibodi-antigen.
9 Pengocok: untuk menginkubasi antibodi.
10Mikropipet: untuk pendistribusian reagen dan sampel secara presisi.
11 Membran: Membran PVDF atau membran nitroselulosa biasanya digunakan untuk transfer protein dan deteksi antibodi.

Langkah-langkah Western Blotting

Persiapan Sampel

Lisis sel

Ekstraksi protein dari sel atau jaringan. Larutan lisis yang umum digunakan mengandung penghambat protease dan penghambat fosfatase untuk menghindari degradasi sampel selama ekstraksi.

Kuantifikasi protein

Konsentrasi protein ditentukan dengan metode BCA dan metode Bradford.

Pemisahan Elektroforesis (SDS-PAGE)

Persiapan sampel

Sampel dicampur dengan larutan penyangga sampel SDS dan dipanaskan pada suhu 95 °C selama 5-10 menit untuk memastikan denaturasi protein yang sempurna.

Elektroforesis gel

Sampel protein yang telah diolah dimasukkan ke dalam gel SDS-PAGE, biasanya menggunakan gel poliakrilamida. Penerapan medan listrik membuat protein terpisah berdasarkan ukuran molekulnya, dan protein dengan berat molekul kecil bermigrasi lebih cepat.

Film Transfer

Transfer protein

Protein yang telah dipisahkan kemudian dipindahkan ke membran nitroselulosa (membran NC) atau membran polivinilidena fluorida (membran PVDF) melalui proses elektrotransfer.

Pemblokiran

Untuk mengurangi pengikatan non-spesifik, larutan pemblokir yang mengandung emulsi tanpa lemak (BSA atau susu bubuk skim) digunakan untuk memblokir area kosong pada membran, biasanya selama 1 jam.

Inkubasi Antibodi

Inkubasi antibodi primer

Membran tersebut ditambahkan dengan larutan yang mengandung antibodi primer spesifik (antibodi utama terhadap protein target), biasanya diinkubasi selama 1 jam hingga semalaman.

Pencucian

Cuci membran dengan TBS-T (TBS dengan Tween-20) untuk menghilangkan antibodi primer yang tidak terikat.

Inkubasi antibodi sekunder

Inkubasi dengan antibodi sekunder berlabel (biasanya HRP atau antibodi sekunder berlabel fluoresen), antibodi sekunder dapat berikatan dengan antibodi primer dan memperkuat sinyal.

Deteksi Sinyal

Deteksi kemiluminesensi

Jika antibodi sekunder berlabel HRP digunakan, substrat kemiluminesensi (seperti ECL) ditambahkan, dan sinyal kemiluminesensi yang dapat dideteksi oleh instrumen paparan dihasilkan melalui reaksi kimia.

Deteksi fluoresensi

Jika antibodi sekunder berlabel fluoresen digunakan, antibodi tersebut dideteksi oleh perangkat pencitraan fluoresensi.

Analisis Hasil

Pencitraan pita protein

Sinyal yang ditangkap oleh sistem pencitraan akan ditampilkan sebagai pita protein, dan intensitas pita tersebut berkaitan dengan ekspresi protein target.

Analisis kuantitatif

Intensitas pita dianalisis oleh perangkat lunak, dan tingkat ekspresi protein target dihitung dan dibandingkan dengan protein referensi internal (seperti β-aktin atau GAPDH).

Gambar 1. Representasi skematis dari Prosedur Western Blotting. (Sumber referensi: Pemurnian dan analisis protein: teknik Western blotting generasi berikutnya.)

Pertanyaan yang Sering Diajukan (FAQ)

1. Apa perbedaan antara membran nitroselulosa dan membran PVDF?

Membran nitroselulosa lebih mudah ditangani, memiliki noise latar belakang yang lebih rendah, dan cocok untuk banyak aplikasi. Namun, kapasitas pengikatan proteinnya terbatas. Membran PVDF memiliki kapasitas pengikatan protein yang lebih tinggi dan lebih tahan lama, sehingga ideal untuk penyimpanan protein hasil blotting dalam jangka panjang. Membran ini memerlukan aktivasi dengan metanol sebelum digunakan.
2. Bagaimana cara mengatasi latar belakang tinggi pada diagram Western blotting?

Sinyal latar belakang yang tinggi dalam Western blotting sering disebabkan oleh pengikatan antibodi non-spesifik atau pemblokiran yang tidak lengkap. (1) Optimalisasi larutan pemblokiran: Pemblokiran sangat penting untuk mencegah pengikatan antibodi non-spesifik ke membran. Pemblokir umum meliputi susu bubuk skim, albumin serum sapi (BSA) atau buffer pemblokiran komersial. (2) Perbaiki Langkah Pencucian: Pencucian yang tidak memadai antar langkah dapat menyebabkan pengikatan antibodi residual, meningkatkan latar belakang. Pastikan pencucian menyeluruh dengan buffer pencucian yang sesuai (biasanya TBST atau PBST) untuk menghilangkan antibodi yang tidak terikat. Tingkatkan jumlah pencucian atau durasi pencucian jika perlu, terutama jika latar belakang yang tinggi tetap ada. Menggunakan terlalu banyak antibodi dapat menyebabkan pengikatan non-spesifik dan menyebabkan latar belakang yang tinggi. Cobalah untuk mengencerkan antibodi primer atau sekunder lebih lanjut, atau gunakan antibodi yang lebih spesifik untuk menurunkan latar belakang.
3. Garis-garis buram atau tidak jelas.

Garis-garis yang buram atau tidak jelas pada Western blot dapat disebabkan oleh pemisahan elektroforesis yang tidak sempurna atau transfer membran yang tidak memadai. Jika protein tidak terpisah dengan baik selama elektroforesis, pita-pita yang kabur dapat muncul. Sesuaikan waktu berjalan, tegangan, dan konsentrasi gel elektroforesis untuk mencapai pemisahan protein yang jelas. Transfer protein yang tidak sempurna dari gel ke membran dapat menyebabkan pita yang buram atau hilang. Pastikan jenis membran yang sesuai (misalnya PVDF atau nitroselulosa) digunakan dan kondisi transfer optimal. Sesuaikan tegangan transfer, waktu, dan komposisi buffer jika perlu.
4. Sinyalnya terlalu lemah saat terkena paparan.

(1) Tingkatkan konsentrasi antibodi: Jika konsentrasi antibodi terlalu rendah, sinyal mungkin terlalu lemah untuk dideteksi dengan benar. Pertimbangkan untuk meningkatkan konsentrasi antibodi pertama atau antibodi kedua, dan lakukan titrasi antibodi untuk menemukan konsentrasi antibodi optimal guna meningkatkan pengikatan ke protein target. (2) Pastikan transfer membran yang lengkap: Transfer protein yang tidak lengkap dari gel ke membran juga dapat menyebabkan sinyal lemah atau hilang. Setelah transfer, membran diperiksa menggunakan pewarnaan protein reversibel untuk memastikan transfer protein yang benar. Jika efisiensi transmisi rendah, kondisi seperti tegangan, waktu, komposisi buffer, dan peralatan transmisi dioptimalkan. (3) Perpanjang waktu paparan: Jika sinyal terlalu lemah, seimbangkan waktu paparan dan kejelasan sinyal, dan gunakan durasi paparan uji yang berbeda untuk menemukan waktu terbaik guna memberikan rasio sinyal-ke-noise yang baik.

referensi

[1] Sule R, Rivera G, Gomes AV. Western blotting (immunoblotting): sejarah, teori, penggunaan, protokol dan masalah. Biotechniques. 2023;75(3):99-114. doi:10.2144/btn-2022-0034

[2] Kurien, BT, & Scofield, RH (2015). Western blotting: sebuah pengantar. Metode dalam biologi molekuler (Clifton, NJ), 1312, 17–30. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2694-7_5

[3] Mishra M, Tiwari S, Gomes AV. Pemurnian dan analisis protein: teknik Western blotting generasi berikutnya. Expert Rev Proteomics. 2017;14(11):1037-1053. doi:10.1080/14789450.2017.1388167

[4] Kurien BT, Scofield RH. Western blotting. Metode. 2006;38(4):283-293. doi:10.1016/j.ymeth.2005.11.007

[5] Hnasko TS, Hnasko RM. Western Blot. Methods Mol Biol. 2015;1318:87-96. doi:10.1007/978-1-4939-2742-5_9