Protokol Western Blotting dan FAQ

Western blotting merupakan teknik yang banyak digunakan baik dalam penelitian ilmiah maupun diagnostik klinis, yang menyediakan metode yang andal untuk menganalisis protein dalam campuran kompleks. Teknik ini terutama digunakan untuk mendeteksi protein tertentu, serta menentukan kelimpahan relatifnya dalam berbagai sampel. Dengan memanfaatkan antibodi spesifik yang mengikat protein target, Western blotting memungkinkan identifikasi dan kuantifikasi protein yang diinginkan dalam sampel heterogen. Teknik ini sangat berharga dalam studi proses pemurnian protein, yang memungkinkan peneliti untuk menilai kemurnian dan keberadaan protein pada berbagai tahap pemurnian. Selain itu, Western blotting memainkan peran penting dalam mengevaluasi tingkat ekspresi protein dalam sel dalam berbagai kondisi eksperimen, seperti sebagai respons terhadap obat, stres, atau penyakit. Fleksibilitasnya telah menjadikannya landasan dalam banyak bidang, termasuk biologi sel, biologi molekuler, biokimia, dan diagnostik klinis, yang digunakan untuk menyelidiki mekanisme molekuler yang mendasari penyakit, termasuk kanker, gangguan neurodegeneratif, dan kondisi terkait imun.

Sejarah Western blotting bermula pada tahun 1979, ketika ahli biologi Inggris Alistair J. Towbin dan rekan-rekannya pertama kali mengusulkan dan menerapkan metode ini dalam penelitian mereka. Towbin dkk. awalnya menggunakan elektroforesis untuk memisahkan protein dan memindahkannya melalui membran polietilen, kemudian melakukan deteksi spesifik melalui antibodi. Metode ini telah banyak digunakan dalam penelitian biologi sel dan biologi molekuler, dan telah menjadi salah satu teknik standar emas untuk analisis protein.

Prinsip Western Blotting

Pemisahan Protein

Pertama, protein dalam sampel dipisahkan dengan elektroforesis gel (biasanya SDS-PAGE, elektroforesis gel poliakrilamid) menurut ukuran molekul.

Transfer Protein

Protein yang dipisahkan kemudian dipindahkan melalui elektroforesis ke media padat, biasanya membran polivinilidena fluorida (PVDF) atau membran nitroselulosa.

Deteksi Antibodi

Pada membran yang ditransfer, antibodi spesifik digunakan untuk mengenali protein target. Antibodi ini biasanya diberi label (seperti pelabelan enzim) dan dapat menghasilkan sinyal yang dapat diukur (seperti chemiluminescence).

Deteksi Sinyal

Sinyal reaksi antibodi-antigen diperoleh dengan sistem deteksi yang tepat (seperti perangkat pencitraan kemiluminesensi) untuk mencapai analisis kualitatif dan kuantitatif dari protein target.

Reagen dan Instrumen yang dibutuhkan

1Buffer elektroforesis: digunakan untuk pemisahan protein dalam gel SDS-PAGE dan sistem elektroforesis.
2Larutan pemblokiran: seperti susu skim bubuk atau BSA, untuk mencegah pengikatan antibodi non-spesifik.
3Antibodi primer dan antibodi sekunder: Antibodi primer adalah antibodi spesifik terhadap protein target, dan antibodi sekunder umumnya berupa antibodi berlabel enzim yang terikat pada antibodi primer.
4Larutan substrat: seperti substrat kemiluminesensi atau substrat kolorimetri, digunakan untuk deteksi sinyal antibodi berlabel.
5Kalibrator protein: Standar protein seperti ukuran yang telah ditentukan sebelumnya digunakan untuk mengonfirmasi berat molekul protein dalam sampel.
6Sistem elektroforesis gel SDS-PAGE: untuk pemisahan protein.
7Sistem transmembran: digunakan untuk transfer protein dari gel ke membran.
8Sistem pencitraan kemiluminesensi: digunakan untuk mendeteksi sinyal setelah reaksi antibodi-antigen.
9Shaker : untuk menginkubasi antibodi.
10Mikropipettor: untuk pengeluaran reagen dan sampel yang tepat.
11Membran: Membran PVDF atau membran nitroselulosa biasanya digunakan untuk transfer protein dan deteksi antibodi.

Tahapan Western Blotting

Persiapan Sampel

Lisis sel

Ekstraksi protein dari sel atau jaringan. Penyangga lisis yang umum digunakan mengandung inhibitor protease dan inhibitor fosfatase untuk menghindari degradasi sampel selama ekstraksi.

Kuantifikasi protein

Konsentrasi protein ditentukan dengan metode BCA dan metode Bradford.

Pemisahan Elektroforesis (SDS-PAGE)

Persiapan sampel

Sampel dicampur dengan buffer sampel SDS dan dipanaskan pada suhu 95 °C selama 5-10 menit untuk memastikan denaturasi protein lengkap.

Elektroforesis gel

Sampel protein yang telah diolah dimasukkan ke dalam gel SDS-PAGE, biasanya menggunakan gel poliakrilamid. Penerapan medan listrik membuat protein terpisah menurut ukuran molekulnya, dan protein dengan berat molekul kecil bermigrasi lebih cepat.

Film Transfer

Transfer protein

Protein yang dipisahkan dipindahkan ke membran nitroselulosa (membran NC) atau membran polivinilidena fluorida (membran PVDF) melalui transfer elektro.

Pemblokiran

Untuk mengurangi pengikatan non-spesifik, larutan pemblokiran yang mengandung emulsi non-lemak (BSA atau bubuk susu skim) digunakan untuk memblokir area kosong pada membran, biasanya selama 1 jam.

Inkubasi Antibodi

Inkubasi antibodi primer

Membran ditambahkan dengan larutan yang mengandung antibodi primer spesifik (antibodi utama terhadap protein target), biasanya diinkubasi selama 1 jam hingga semalaman.

Pencucian

Cuci membran dengan TBS-T (TBS dengan Tween-20) untuk menghilangkan antibodi primer yang tidak terikat.

Inkubasi antibodi sekunder

Inkubasi dengan antibodi sekunder berlabel (biasanya HRP atau antibodi sekunder berlabel fluoresensi), antibodi sekunder dapat mengikat antibodi primer dan memperkuat sinyal.

Deteksi Sinyal

Deteksi kemiluminesensi

Jika antibodi sekunder berlabel HRP digunakan, substrat kemiluminesensi (seperti ECL) ditambahkan, dan sinyal kemiluminesensi yang dapat dideteksi oleh instrumen paparan dihasilkan melalui reaksi kimia.

Deteksi fluoresensi

Jika antibodi sekunder berlabel fluoresensi digunakan, antibodi tersebut dideteksi oleh perangkat pencitraan fluoresensi.

Analisis Hasil

Pencitraan pita protein

Sinyal yang ditangkap oleh sistem pencitraan akan ditampilkan sebagai pita protein, dan intensitas pita terkait dengan ekspresi protein target.

Analisis kuantitatif

Intensitas pita dianalisis oleh perangkat lunak, dan tingkat ekspresi protein target dihitung dan dibandingkan dengan protein referensi internal (seperti β-aktin atau GAPDH).

Gambar 1. Representasi skematik Prosedur Western Blotting. (Sumber referensi:Pemurnian dan analisis protein: teknik Western blotting generasi berikutnya.)

Tanya Jawab Umum

1. Apa perbedaan antara membran nitrocellulose dan PVDF?

Membran nitrocellulose lebih mudah ditangani, memiliki kebisingan latar belakang yang lebih rendah, dan cocok untuk banyak aplikasi. Namun, membran ini memiliki kapasitas pengikatan protein yang terbatas. Membran PVDF memiliki kapasitas pengikatan protein yang lebih tinggi dan lebih tahan lama, sehingga ideal untuk penyimpanan protein yang telah diblotting dalam jangka panjang. Membran ini memerlukan aktivasi dengan metanol sebelum digunakan.
2. Bagaimana cara mengatasi diagram Western blotting berlatar belakang tinggi?

Sinyal latar belakang yang tinggi dalam Western blotting sering kali disebabkan oleh pengikatan antibodi non-spesifik atau pemblokiran yang tidak lengkap. (1) Optimalisasi larutan pemblokiran: Pemblokiran sangat penting untuk mencegah pengikatan antibodi non-spesifik ke membran. Penghambat umum termasuk susu skim bubuk, bovine serum albumin (BSA) atau buffer pemblokiran komersial. (2) Perbaiki Langkah Pencucian: Pencucian yang tidak memadai di antara langkah-langkah dapat menyebabkan pengikatan antibodi residual, meningkatkan latar belakang. Pastikan pencucian menyeluruh dengan buffer pencucian yang sesuai (biasanya TBST atau PBST) untuk menghilangkan antibodi yang tidak terikat. Tingkatkan jumlah pencucian atau durasi pencucian jika perlu, terutama jika latar belakang tinggi terus berlanjut. Menggunakan terlalu banyak antibodi dapat menyebabkan pengikatan non-spesifik dan menyebabkan latar belakang yang tinggi. Cobalah untuk lebih mengencerkan antibodi primer atau sekunder, atau gunakan antibodi yang lebih spesifik untuk menurunkan latar belakang.
3. Garis-garis kabur atau tidak jelas.

Garis-garis yang kabur atau tidak jelas pada Western blot dapat disebabkan oleh pemisahan elektroforesis yang tidak lengkap atau transfer membran yang tidak memadai. Jika protein tidak dipisahkan dengan baik selama elektroforesis, pita-pita kabur dapat muncul. Sesuaikan waktu pengoperasian, voltase, dan konsentrasi gel elektroforesis untuk memperoleh pemisahan protein yang jelas. Transfer protein yang tidak lengkap dari gel ke membran dapat menyebabkan pita-pita kabur atau hilang. Pastikan bahwa jenis membran yang tepat (misalnya PVDF atau nitrocellulose) digunakan dan bahwa kondisi transfer optimal. Sesuaikan voltase transfer, waktu, dan komposisi buffer jika perlu.
4. Sinyal terlalu lemah saat terpapar.

(1) Tingkatkan konsentrasi antibodi: Jika konsentrasi antibodi terlalu rendah, sinyal mungkin terlalu lemah untuk dideteksi dengan benar. Pertimbangkan untuk meningkatkan konsentrasi antibodi pertama atau antibodi kedua, dan lakukan titrasi antibodi untuk menemukan konsentrasi antibodi yang optimal untuk meningkatkan pengikatan ke protein target. (2) Pastikan transfer membran lengkap: Transfer protein yang tidak lengkap dari gel ke membran juga dapat menyebabkan sinyal yang lemah atau hilang. Setelah transfer, membran diperiksa menggunakan pewarnaan protein reversibel untuk memastikan transfer protein yang benar. Jika efisiensi transmisi rendah, kondisi seperti tegangan, waktu, komposisi buffer, dan peralatan transmisi dioptimalkan. (3) Perpanjang waktu paparan: Jika sinyal terlalu lemah, seimbangkan waktu paparan dan kejernihan sinyal, dan gunakan durasi paparan uji yang berbeda untuk menemukan waktu terbaik untuk memberikan rasio signal-to-noise yang baik.

referensi

[1] Sule R, Rivera G, Gomes AV. Western blotting (imunoblotting): sejarah, teori, penggunaan, protokol dan masalah. Bioteknik. 2023;75(3):99-114. doi:10.2144/btn-2022-0034

[2] Kurien, BT, & Scofield, RH (2015). Western blotting: pengantar. Metode dalam biologi molekuler (Clifton, NJ), 1312, 17–30. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2694-7_5

[3] Mishra M, Tiwari S, Gomes AV. Pemurnian dan analisis protein: teknik Western blotting generasi berikutnya. Expert Rev Proteomics. 2017;14(11):1037-1053. doi:10.1080/14789450.2017.1388167

[4] Kurien BT, Scofield RH. Western blotting. Metode. 2006;38(4):283-293. doi:10.1016/j.ymeth.2005.11.007

[5] Hnasko TS, Hnasko RM. Western Blot. Metode Mol Biol. 2015;1318:87-96. doi:10.1007/978-1-4939-2742-5_9