Layanan Penyaringan Perpustakaan Tampilan Permukaan Ragi

Alpha Lifetech mengkhususkan diri dalam pembuatan pustaka tampilan ragi dan penyaringan pustaka antibodi, menawarkan kemampuan untuk menghasilkan berbagai bentuk pustaka ragi dan menyaringnya untuk antibodi dengan afinitas tinggi dan spesifik bagi klien di seluruh dunia. Dengan tim peneliti ahli, teknologi dan peralatan canggih, kami dapat membangun pustaka ragi yang menargetkan berbagai protein terkait penyakit. Kami dapat menyediakan teknologi tampilan fage dan tampilan ragi, termasuk tampilan ragi protein, tampilan ragi molekul kecil, tampilan ragi antibodi, dll.

Pustaka tampilan ragi kami memiliki kapasitas besar dan keragaman tinggi, yang memberikan dasar yang kuat untuk penyaringan efektif sekuens antibodi spesifik. Kami dapat membangun berbagai bentuk pustaka tampilan ragi antibodi (pustaka antibodi IgG, scFv, VHH, Fab), pustaka protein, pustaka peptida, pustaka cDNA, dll. sesuai kebutuhan Anda. Selain itu, kami juga dapat mengembangkan pustaka antibodi dengan berbagai sifat, termasuk pustaka imun, pustaka alami, pustaka sintetik, pustaka semi-sintetik, dan pustaka antibodi penyakit.

Pengantar Sistem Tampilan Ragi

Teknologi tampilan permukaan ragi adalah metode untuk menampilkan protein rekombinan pada permukaan ragi melalui fusi gen. Sistem tampilan ragi yang paling umum menggunakan protein target yang difusikan ke ujung C subunit Aga2p dari protein perkawinan lektin alfa, terutama terdiri dari tag epitop di kedua sisi protein target: tag hemaglutinin (HA) 9 asam amino di ujung N dan tag c-myc 10 asam amino di ujung C. Subunit Aga2p 69 asam amino berikatan dengan subunit lektin alfa Aga1p 725 asam amino melalui dua ikatan disulfida, dan Aga1p ditambatkan ke dinding sel melalui ikatan kovalen β 1,6-glukan. Oleh karena itu, protein target ditampilkan pada permukaan sel ragi dan kemudian dikenali oleh ligan yang sesuai. Protein fungsional dipisahkan dari pustaka melalui penyaringan sitometri aliran.

Gambar 1: Prinsip tampilan permukaan ragi. (Sumber gambar: Aplikasi Tampilan Permukaan Ragi untuk Rekayasa Protein.)

Pengantar Perpustakaan Tampilan Permukaan Ragi

Penyortiran tampilan ragi didasarkan pada tampilan permukaan ragi, terutama digunakan untuk menyaring pustaka antibodi yang menargetkan protein permukaan sel. Karena ikatan non-spesifik yang rendah antara sel ragi dan permukaan sel lainnya, seleksi biologis ragi dapat menyaring pustaka pengikatan besar untuk menemukan klon langka.

Layanan Penyaringan Perpustakaan Tampilan Permukaan Ragi

Siapkan plasmid dan kultur sel ragi, sintesis DNA yang mengkode protein target dan klon ke dalam vektor ekspresi ragi yang mengandung promotor yang dapat diinduksi, peptida sinyal, dan gen target yang digabungkan dengan protein tampilan permukaan (seperti Aga2p). Gen yang mengkode protein target dapat digabungkan dengan gen yang mengkode protein dinding sel ragi (biasanya Aga2p), dan gen gabungan tersebut dapat ditransformasikan ke dalam sel ragi melalui elektroporasi. Setelah transformasi, sel ragi yang mengekspresikan gen antibodi di permukaannya dapat menjalani uji penyaringan spesifik antigen: pustaka ragi diinkubasi dengan antigen target dan sel ragi yang secara spesifik mengikatnya dipilih. Dengan menggunakan pemilahan sel yang diaktifkan fluoresensi (FACS) untuk mengisolasi sel ragi yang menampilkan protein dengan karakteristik yang diinginkan, penyaringan pustaka tampilan ragi dapat dilakukan dengan ukuran pustaka maksimum sekitar 10^8-10^9 sel ragi. Klon positif kemudian dapat diisolasi untuk analisis lebih lanjut atau aplikasi selanjutnya. Setelah klon antibodi spesifik diidentifikasi dari pustaka antibodi, klon tersebut dapat dikarakterisasi lebih lanjut dan diproduksi secara massal, serta dimurnikan menggunakan teknik seperti kromatografi afinitas protein A/G untuk menyelesaikan seluruh proses penyaringan tampilan ragi dan produksi antibodi.

Proses Penyaringan Perpustakaan Tampilan Ragi

Gambar 2 Proses penyaringan pustaka tampilan ragi

Alur Kerja Layanan Penyaringan Perpustakaan Tampilan Ragi

Tangga	Konten Layanan	Garis waktu
Persiapan Antigen	Jenis antigen: Jika pelanggan dapat menyediakan antigen, sampel yang sesuai perlu dikirimkan sesuai dengan jenisnya: protein rekombinan membutuhkan 3-3,5 mg dengan persyaratan kemurnian lebih dari 85%, molekul kecil perlu dikonjugasikan dengan persyaratan kemurnian lebih dari 90%, sintesis peptida perlu dikonjugasikan dengan persyaratan kemurnian lebih dari 90%, jenis sampel seperti virus perlu dinonaktifkan, RNA perlu diperiksa untuk mencegah degradasi, dan jenis antigen di atas juga dapat disesuaikan untuk sintesis.	2-3 minggu
Imunitas Hewan	Jumlah imunisasi hewan adalah 5, dan perlu ditentukan apakah perlu meningkatkan jumlah imunisasi berdasarkan pengujian titer serum. Imunitas antigen: potensi antigen protein/virus > 10⁵; potensi antigen peptida/molekul kecil > 10⁴	5-6 minggu
Persiapan Templat cDNA	Pisahkan plasma PBMC, ekstrak total RNA (kit ekstraksi RNA) dan ubah menjadi cDNA.	1 hari
Pembangunan Perpustakaan	Dengan menggunakan cDNA pustaka sebagai templat, gen VHH diamplifikasi melalui dua putaran PCR, dan vektor tampilan ragi penyambung gen VHH dibangun. Vektor tersebut ditransformasikan ke dalam sel ragi melalui elektroporasi untuk membangun pustaka antibodi. Sebanyak 48 klon dipilih secara acak dan tingkat positif (>90%) diidentifikasi menggunakan metode PCR; kapasitas pustaka dihitung (10^7-10^8), sekuensing NGS dilakukan untuk menentukan tingkat penyisipan pustaka yang benar (>90%) dan keragaman pustaka.	2 minggu
Pemutaran Film di Perpustakaan	Proses penyaringan standar terdiri dari tiga putaran: penyaringan FACS protein berlabel fluoresensi, diikuti oleh pengurutan NGS pada putaran ketiga. Klon positif dipilih untuk ekspresi induksi gram tunggal dan deteksi ELISA. Semua klon positif dipilih untuk pengurutan gen, dan urutan wilayah CDR yang berbeda dipilih.	2-3 minggu
Verifikasi Antibodi	Pembuatan vektor ekspresi yang sesuai untuk sekuens antibodi dapat mempermudah ekspresi antibodi, pemurnian antibodi, validasi ELISA dan BLI terhadap pengikatan antigen antibodi untuk memverifikasi afinitas antibodi, dan blokade sitometri aliran untuk memvalidasi fungsi sel.	1 minggu

Kasus Penyaringan Perpustakaan Tampilan Permukaan Ragi

Dalam literatur platform tampilan permukaan ragi untuk penemuan cepat nanobodi selektif konformasi, penulis membangun platform penemuan nanobodi in vitro lengkap berdasarkan tampilan permukaan ragi. Pertama, pustaka nanobodi sintetis dirancang mulai dari gen unta. Gambar D menunjukkan bahwa nanobodi memiliki tag HA di ujung karboksil, dan kemudian nanobodi tersebut diikat secara kovalen pada dinding sel ragi. Gambar E menunjukkan proses penyaringan nanobodi. Ragi dengan nanobodi afinitas antigen diisolasi, diperbanyak, dan dipilih berulang kali untuk antibodi dengan FACS. Penulis menemukan nanobodi selektif konformasi yang menargetkan dua GPCR manusia yang berbeda melalui platform ini.