Layanan Penyaringan Pustaka Tampilan Permukaan Ragi

Alpha Lifetech mengkhususkan diri dalam pembuatan pustaka tampilan ragi dan penyaringan pustaka antibodi, yang menawarkan kemampuan untuk menghasilkan berbagai bentuk pustaka ragi dan menyaringnya untuk antibodi afinitas tinggi dan spesifik bagi klien di seluruh dunia. Dengan tim peneliti ahli, teknologi dan peralatan canggih, kami dapat membangun pustaka ragi yang menargetkan berbagai macam protein terkait penyakit. Kami dapat menyediakan teknologi tampilan fag dan tampilan ragi, termasuk tampilan ragi protein, tampilan ragi molekul kecil, tampilan ragi antibodi, dll.

Pustaka tampilan ragi kami memiliki kapasitas besar dan keragaman tinggi, yang menyediakan dasar yang kuat untuk penyaringan urutan antibodi spesifik yang efektif. Kami dapat membuat berbagai bentuk pustaka tampilan ragi antibodi (pustaka antibodi IgG, scFv, VHH, Fab), pustaka protein, pustaka peptida, pustaka cDNA, dll. sesuai dengan kebutuhan Anda. Selain itu, kami juga dapat mengembangkan pustaka antibodi dengan berbagai sifat, termasuk pustaka imun, pustaka alami, pustaka sintetis, pustaka semi-sintetis, dan pustaka antibodi penyakit.

Pengantar Sistem Tampilan Ragi

Teknologi tampilan permukaan khamir adalah metode untuk menampilkan protein rekombinan pada permukaan khamir melalui fusi gen. Sistem tampilan khamir yang paling umum menggunakan protein target yang menyatu dengan C-terminus subunit Aga2p dari protein pasangan lektin alfa, yang sebagian besar terdiri dari tag epitop di kedua sisi protein target: tag hemaglutinin (HA) asam amino 9 N-terminal dan tag c-myc asam amino 10 C-terminus. Subunit Aga2p yang terdiri dari 69 asam amino berikatan dengan subunit lektin alfa Aga1p yang terdiri dari 725 asam amino melalui dua ikatan disulfida, dan Aga1p ditambatkan ke dinding sel melalui ikatan kovalen β 1,6-glukan. Oleh karena itu, protein target ditampilkan pada permukaan sel khamir dan selanjutnya dikenali oleh ligan yang sesuai. Pisahkan protein fungsional dari perpustakaan melalui penyaringan sitometri aliran.

Gambar 1: Prinsip tampilan permukaan ragi. (Sumber gambar:Aplikasi Tampilan Permukaan Ragi untuk Rekayasa Protein.)

Pengantar Perpustakaan Tampilan Permukaan Ragi

Penyortiran tampilan ragi didasarkan pada tampilan permukaan ragi, yang terutama digunakan untuk menyaring pustaka antibodi yang menargetkan protein permukaan sel. Karena ikatan non-spesifik yang rendah antara sel ragi dan permukaan sel lainnya, seleksi biologis ragi dapat menyaring pustaka ikatan yang besar untuk menemukan klon yang langka.

Layanan Penyaringan Pustaka Tampilan Permukaan Ragi

Siapkan plasmid dan kultur sel khamir, sintesis DNA yang mengkode protein target dan kloning ke dalam vektor ekspresi khamir yang berisi promotor yang dapat diinduksi, peptida sinyal, dan gen target yang menyatu dengan protein tampilan permukaan (seperti Aga2p). Gen yang mengkode protein target dapat menyatu dengan gen yang mengkode protein dinding sel khamir (biasanya Aga2p), dan gen yang menyatu dapat ditransformasikan ke dalam sel khamir melalui elektroporasi. Setelah transformasi, sel khamir yang mengekspresikan gen antibodi pada permukaannya dapat menjalani uji skrining spesifik antigen: pustaka khamir diinkubasi dengan antigen target dan sel khamir yang secara spesifik mengikatnya dipilih. Menggunakan penyortiran sel yang diaktifkan fluoresensi (FACS) untuk mengisolasi sel khamir yang menampilkan protein dengan karakteristik yang diinginkan, skrining pustaka tampilan khamir dapat dilakukan dengan ukuran pustaka maksimum ~10 ^ 8-10 ^ 9 sel khamir. Klon positif kemudian dapat diisolasi untuk analisis lebih lanjut atau aplikasi hilir. Setelah klon antibodi spesifik diidentifikasi dari perpustakaan antibodi, klon tersebut dapat dikarakterisasi lebih lanjut dan diproduksi secara massal, serta dimurnikan menggunakan teknik seperti kromatografi afinitas protein A/G untuk melengkapi seluruh proses penyaringan tampilan ragi dan produksi antibodi.

Proses Penyaringan Pustaka Tampilan Ragi

Gambar 2. Proses penyaringan pustaka tampilan ragi

Alur Kerja Layanan Penyaringan Pustaka Tampilan Ragi

Tangga	Konten Layanan	Garis Waktu
Persiapan Antigen	Jenis antigen: Jika pelanggan dapat menyediakan antigen, sampel yang sesuai perlu dikirimkan sesuai dengan jenisnya: protein rekombinan memerlukan 3-3,5 mg dengan persyaratan kemurnian lebih dari 85%, molekul kecil perlu dikonjugasikan dengan persyaratan kemurnian lebih dari 90%, sintesis peptida perlu dikonjugasikan dengan persyaratan kemurnian lebih dari 90%, jenis sampel seperti virus perlu dinonaktifkan, RNA perlu diperiksa untuk mencegah degradasi, dan jenis antigen di atas juga dapat disesuaikan untuk sintesis.	2-3 minggu
Kekebalan Hewan	Jumlah imunisasi hewan adalah 5, dan perlu untuk menentukan apakah akan menambah jumlah imunisasi berdasarkan pengujian titer serum. Kekebalan antigen: potensi antigen protein/virus>105; potensi antigen peptida/molekul kecil>10^4	5-6 minggu
Persiapan cDNA Template	Pisahkan PBMC plasma, ekstrak total RNA (kit ekstraksi RNA) dan balikkan menjadi cDNA.	1 hari
Pembangunan Perpustakaan	Dengan menggunakan cDNA pustaka sebagai templat, gen VHH diperkuat melalui dua putaran PCR, dan vektor tampilan ragi penyambung gen VHH dibuat. Vektor tersebut ditransformasikan ke dalam sel ragi melalui elektroporasi untuk membuat pustaka antibodi. Pilih secara acak 48 klon dan identifikasi rasio positif (>90%) menggunakan metode PCR; Hitung kapasitas pustaka (10^7-10^8), pengurutan NGS untuk menentukan rasio penyisipan pustaka yang benar (>90%) dan keragaman pustaka.	2 minggu
Penyaringan Perpustakaan	Tiga putaran penyaringan standar: penyaringan protein berlabel fluoresensi FACS, diikuti oleh pengurutan NGS pada putaran ketiga. Klon positif dipilih untuk ekspresi induksi gram tunggal dan deteksi ELISA. Semua klon positif dipilih untuk pengurutan gen, dan urutan wilayah CDR yang berbeda dipilih.	2-3 minggu
Verifikasi Antibodi	Membangun vektor ekspresi yang tepat untuk rangkaian antibodi dapat memfasilitasi ekspresi antibodi, pemurnian antibodi, validasi ELISA dan BLI terhadap pengikatan antigen antibodi untuk memverifikasi afinitas antibodi, dan blokade sitometri aliran untuk memvalidasi fungsi sel.	1 minggu

Kasus Penyaringan Pustaka Tampilan Permukaan Ragi

Dalam literatur platform tampilan permukaan ragi untuk penemuan cepat nanobodi selektif konformasi, penulis membuat platform penemuan nanobodi in vitro lengkap berdasarkan tampilan permukaan ragi. Pertama, pustaka nanobodi sintetis dirancang mulai dari gen unta. Gambar D menunjukkan bahwa nanobodi memiliki tag HA di ujung karboksil, dan kemudian nanobodi tersebut difiksasi secara kovalen pada dinding sel ragi. Gambar E menunjukkan proses penyaringan nanobodi. Ragi dengan nanobodi afinitas antigen diisolasi, diperkuat, dan dipilih berulang kali untuk antibodi oleh FACS. Penulis menemukan nanobodi selektif konformasi yang menargetkan dua GPCR manusia yang berbeda melalui platform ini.