Þjónusta við greiningu á prótein-prótein víxlverkun

Alpha Lifetech getur einnig veitt viðskiptavinum próteinmælingar, greiningu á próteinvíxlverkun, prótein-prótein víxlverkunarmælingar (CO-IP, Western Blot, krómatín ónæmisútfellingarmæling) og próteinvirknimælingar til að mæta tilraunaþörfum mismunandi viðskiptavina.

HAFIÐ SAMBAND VIÐ OKKUR

Þjónusta við greiningu á prótein-prótein víxlverkun

Alpha Lifetech hefur unnið djúpt í próteinmælingum í mörg ár, byggt upp traustan vettvang fyrir mælingar á virkni próteina og náð tökum á ýmsum tæknilegum aðferðum til að staðfesta víxlverkun próteina, sem getur sparað tíma í vísindarannsóknum eða verkefnum og skilað stöðugum niðurstöðum.

Inngangur að prótein-prótein víxlverkunarprófi

Prótein eru mikilvægustu framkvæmdasameindirnar í öllum lífsformum og bregðast við fyrirmælum sem geymdar eru í erfðaefni. Oftast gegna prótein hlutverki sínu með því að gegna hlutverki sem hefur samskipti við önnur prótein, sem er augljósara þegar virkni próteins er skoðuð í raunverulegu samhengi frumu. Að bera kennsl á víxlverkun milli próteina er mjög mikilvægt fyrir lífefnafræðilega rannsókn á einstökum próteinum. Algengar greiningar á próteinvíxlverkun eru sem hér segir:

Samónæmisútfellingarpróf

Meginreglan á bak við samónæmisútfellingaraðferðina er að blanda saman markpróteininu, sértæka mótefninu og prótein A/G segulperlum til ræktunar, ofanvökva óbundins próteins er fargað með aðsogi segulperlanna á segulgrindina og segulperlurnar eru þvegnar til að fjarlægja próteinið og önnur óhreinindi nema þau séu sérstaklega bundin.

Mynd 1. Skýringarmynd af Co-IP prófunum.(Heimild: Samónæmisútfellingarpróf - PubMed (nih.gov))

Drag-down prófun

Niðurdráttarprófið er notað til að festa þekkt prótein á segulperluna og bæta við efninu sem á að greina. Elúentið er greint til að kanna aðsog próteina sem hafa samskipti.

Árið 1988 hreinsuðu Smith o.fl. GST samruna prótein, sem var notað í pull-down prófunum og kallast Gst pull-down, það er að segja til að bæta GST merki við markpróteinið, fanga víxlverkandi próteinið með GSH, skola bindinguna út og staðfesta hana með WB prófunum.

Mynd 2. Skýringarmynd af GST útdráttarprófum.(Heimild: GST niðurdráttarpróf til að rannsaka PIF4 bindingu in vitro - PubMed (nih.gov) )

Aðferð hans er að nota málmjónir eins og nikkel eða kóbalt sem miðil, hreinsa próteinið með sækniskiljun og skola bindinguna með WB tilraun til staðfestingar.

Að auki eru til DNA Pull-down (prótein DNA bindingarpróf), RNA Pull-down (prótein RNA víxlverkunarpróf) og smásameinda pull-down prófanir.

DNA-pull-down (Prótein DNA-bindingarpróf) er in vitro aðferð til að ákvarða DNA-bindingu próteina. Hvort tiltekin prótein bindist mark-DNA var greint með WB-prófum; óþekkt DNA-brot bundust próteinum, sem DNA-brotin eru þekkt með MS-greiningu.

RNA Pull-down (Protein RNA interaction assay) er in vitro aðferð til að ákvarða RNA bindingu við prótein. Hvort tiltekin prótein bindast mark-RNA var greint með WB prófunum; Óþekkt RNA brot bundust próteinum, sem RNA brot eru þekkt með MS greiningu.

SM-pull-down aðferð (small molecule pull-down assays) getur fundið markprótein sem bindast sértækt við litlar sameindir, og þegar hún er notuð ásamt MS er hægt að skima markprótein lítilla sameinda nákvæmlega, sem má skipta í in vitro merkingaraðferð og líffræðilega rétthyrnda aðferð.

WB tilraun

WB tilraun (einnig þekkt sem Western Blot tilraun eða Western blot), kjarninn er sértæk viðbrögð mótefnavaka og mótefnis. Grunnreglan er að aðskilja denatureruð prótein með SDS pólýakrýlamíð gel rafdrætti og flytja þau yfir á fastfasa burðarefni (eins og PVDF himnu, NC himnu) með himnuflutningi (blaut eða hálfþurr snúningur). Eftir blokkun (með BSA, súrmjólk o.s.frv.) er aðalmótefnið notað til að bindast sértækt við próteinið og flúoresínmerkt aukamótefni er bætt við eftir að filman hefur verið þvegin. Með því að binda annað mótefnið við aðalmótefnið er hægt að sjá markpróteinið með litþróun hvarfefnisins og efnaljómun. Það er almennt notað til að ákvarða hvort tiltekið prótein sé tjáð í sýninu og greina gróflega tjáningarstig þess.

Samanburður á aðferð við prótein-prótein víxlverkun

Prótein-pulldown prófanirnar eru svipaðar Co-IP prófunum, sem báðar tilheyra tilraunum til að greina próteinvíxlverkun. Munurinn á þessum tveimur aðferðum er sá að Co-IP prófanirnar afla víxlverkunarpróteina þekktra próteina, sem hefur ákveðna áreiðanleika en getur ekki staðfest hvort víxlverkun próteinanna hafi bein eða óbein samskipti. Pulldown prófanir eru til að finna óþekkt prótein sem hafa samskipti við þekkt prótein. Þær geta staðfest beint hvort þekkt prótein hafi samskipti við greinda próteinið en geta ekki vitað bindingaraðstæður in vivo.

Samónæmisútfellingartækni er notuð til að greina hvort víxlverkun sé milli tveggja eða fleiri próteina, byggt á ónæmisútfellingartilraunum. Í samanburði við aðrar tilraunaaðferðir til greiningar á próteinvíxlverkun (GST Pull-down, Western Blot, Chromatin immunoprecipitation assay o.s.frv.), hefur Sam-IP tækni meiri sértækni, næmi og mikla endurtekningarnákvæmni, sem getur forðast truflanir ósértækrar bindingar og endurspeglað víxlverkun próteina í náttúrulegu ástandi.

	GST niðurdráttur	Sameiginleg hugverkaréttindi	VB
Kostur	* Auðvelt í notkun *Hentar til hreinsunar á ýmsum próteinum	Fyrir greiningu á víxlverkun in vivo Hægt er að bera kennsl á það með niðurstreymispróteini	Sterk sértækni Eigindleg og megindleg rannsókn in vitro
Takmörkun	Kannski ósértæk binding Nánari staðfesting á samskiptunum er nauðsynleg	Mikil háð mótefnum Ósértæk binding getur komið fyrir	Tímafrekt Erfitt í notkun fyrir stórfellda próteingreiningu
Dæmi um notkun	Greina greiningu á milliverkunum Hreinsað próteinflétta	Rannsókn á merkjasendingu Sjúkdómsferli	Síðari greining á prótein-prótein, prótein-DNA og prótein-RNA víxlverkunum