Flokkunarpallur fyrir staka B-frumur

Einstofna mótefni (mAb) sem brautryðjandi í mótefnalyfjum, meira en 100 einstofna mótefni hafa verið samþykkt til meðferðar við krabbameini, smitsjúkdómum, eigin lyfjaþróunarmarkaði og sýna einstakt lækningalegt gildi sitt. Einstofna B-frumu mótefnatækni, sem ný kynslóð mótefnaþróunartækni, getur einangrað mótefni á skilvirkan og hraðan hátt úr einstofna B-frumum, sem er bylting í mótefnaframleiðslutækni eftir blendingaæxli og fagasýningu. Einstofna B-frumu flokkunartækni er hægt að nota til að mynda mótefni gegn mörgum tegundum eins og kanínum, músum, úlföldum, sauðfé og kjúklingum. Einstofna B-frumu tækni hefur framúrskarandi kosti eins og mikla sértækni, mikla virkni og mikla sækni. Byggt á einstofna B-frumu flokkunarvettvangi hefur Alpha Lifetech kosti í skimunartíma og að fá hágæða mótefni. Það getur veitt mótefnavakahönnun, myndun og breytingu, ónæmi fyrir dýrum, skimun fyrir auðgun á einstofna B-frumum, raðgreiningu á einstofna frumum, skimun með mikilli afköstum, tjáningu og hreinsun, tæknilega þjónustu á einum stað eins og virknisstaðfestingu til að mæta fjölbreyttum þörfum viðskiptavina.

Yfirlit yfir skimunaraðferðir fyrir stakar B-frumur

Aðferðir til að skima stakar B-frumur skiptast aðallega í handahófskennda einangrun og mótefnavaka-sértæka einangrun. Handahófskennd aðskilnaður er nothæfur fyrir sýni með háum styrk af mótefnavaka-sértækri einangrun og aðeins B-frumur eru aðskildar. Það er einfalt í notkun en krefst mikillar vinnu og er oft notað sem fyrsta skrefið í mótefnavaka-sértækri aðskilnaði. Mótefnavaka-sértæk aðskilnaðaraðferð hentar í þeim tilvikum þar sem innihald sértækra mótefna eins og æxlismótefna og sjálfsofnæmismótefna er lágt. Það er tiltölulega flókið að einangra sértækar B-frumur með því að nota ónæmisfræðilega meginregluna um mótefnavaka- og mótefna-sértæka bindingu við frumfrumurnar. Algengar flokkunaraðferðir og kostir og gallar hennar eru sýndir í töflu.

	Aðferðir	Kostir	Ókostir
Handahófskennt Einangrun	Örstjórnun	Lágar kröfur um búnað Einföld aðgerð	Lítil skilvirkni Takmarkaðar gerðir af einangruðum frumum
	Leysigeislunarörvun	Mikil nákvæmni staðsetningar Einföld aðgerð Veldu svipaðar frumur úr sýninu sjónrænt og fjarlægðu óhreinindi	Flókið ferli við sýnishornsundirbúning Vanhæfni til að gera sjálfvirkni
	Flúrljómunarvirkjuð frumuröðun	Mikil nákvæmni og skilvirkni Mikil sjálfvirkni Víðtæk notkun	Flókin aðgerð Miklar kröfur um búnað
Sértæk einangrun mótefnavaka	Flúorkrómmerkt mótefnavaka með fjölbreytu	Mikil nákvæmni og skilvirkni Mikil sjálfvirkni Mikil afköst og fjölbreytubreytur Geta til að einangra B-frumur á mismunandi stigum	Flókin aðgerð Miklar kröfur um búnað
	Segulperlur með mótefnavakahúð	Einföld aðgerð Mikil endurtekningarhæfni Getur auðgað markfrumur B	Flókin aðgerð Segulperlur hafa áhrif á líffræðilega virkni frumna og eru ekki til þess fallnar að rækta og framkvæma þær eftir einangrun.
	Örgrafík	Mikil afköst Mikill hraði	Miklar kröfur um búnað Lítil skilvirkni
	Immunospot array prófun á örgjörva	Mikil sjálfvirkni Mikil nákvæmni og skilvirkni	Flókin aðgerð Hár kostnaður

Aðferð við mótefnaskimun fyrir stakar B-frumur

Ónæmisaðgerðir gegn dýrum

Veljið viðeigandi mótefnavaka fyrir tilraunadýrin (eins og mýs, kanínur o.s.frv.) til ónæmisörvunar, þannig að þau geti framleitt sértæk mótefni gegn mótefnavakanum.

Ónæmingu dýra er fyrsta stig mótefnamyndunar. Ónæmingu dýra er notkun á vessabundnu ónæmissvörunarkerfi lífverunnar sjálfrar. Með stöðugri örvun mótefnavaka framleiða dýrin sterkt ónæmissvörun og seyta síðan sértækum mótefnum gegn tilteknum mótefnavaka.

Söfnun og auðgun B-frumna

B-frumur voru einangraðar úr útlægu blóði, milta eða eitlum ónæmisdýra. Þessar B-frumur hafa verið örvaðar ónæmisfræðilega til að framleiða mótefni gegn tilteknum mótefnavökum.

Með eðlisfræðilegum eða efnafræðilegum aðferðum (eins og þéttleikahallaskiljun, segulkornaaðskilnaði o.s.frv.) er auðgun B-frumna, fjarlæging óhreininda frumna bætt, hreinleiki B-frumna og skilvirkni síðari aðskilnaðar bætt.

Mynd 1 Klónun og undirbúningur á einstofna mótefni úr kanínu. Heimild:Klónun einstakra B-frumna og framleiðsla á einstofna mótefnum í kanínum.)

Flokkun B-frumna

Hægt er að nota flúrljómunarvirkjaða frumuflokkun (FACS), segulfrumuaðskilnað (MACS), örvökvafrumuflokkara (MCS) eða aðrar háafkösta skimunaraðferðir, ásamt mótefnavakasértækri merkingu, til að skima einstakar B-frumur úr auðguðum B-frumum til að framleiða markviss mótefni.

Þegar ein B-fruma er einangruð úr blönduðum B-frumuhópi þarf að raðgreina mótefnagen hennar með einfrumuraðgreiningartækni og greina þau til að fá upplýsingar um DNA-röð breytilegs svæðis þungkeðjunnar (VH) og breytilegs svæðis léttkeðjunnar (VL). Einfrumuraðgreiningartækni felur aðallega í sér þrjú skref: einangrun einstakra frumna, mögnun innanfrumukjarnsýru og raðgreiningu. Meginreglan á bak við einfrumuraðgreiningu er að magna upp snefilmagn af DNA eða RNA úr einangruðum einstökum frumum til að fá heilt erfðamengi eða umrit með mikilli þekju fyrir háafköstarraðgreiningu.

Með háafköstum skimunar er hægt að fá mótefnagenaraðir þúsunda B-frumna í einu, sem hraðar mjög mótefnauppgötvun. Þessar raðupplýsingar er hægt að nota frekar til að smíða og skima mótefnasöfn.

Mynd 2. Skýringarmynd af inntöku einstakra B-frumna, smíði bókasafns, skimun með mikilli afköstum og raðgreiningu.(Heimild: Raðgreining á stórfelldum samsíða B-frumuviðtökum gerir kleift að uppgötva fjölbreytt mótefni sem bregðast við mótefnum hratt.)

Magnun mótefnagena

Ein B-fruma er klofin til að losa mRNA. Síðan voru cDNA-raðir þungkeðjubreytileikasvæðisins (VH) og léttkeðjubreytileikasvæðisins (VL) magnaðar upp með öfugri umritunar-pólýmerasakeðjuverkun (RT-PCR).

Mótefnaframleiðsla og hreinsun

Magnaða breytilega svæðisgenið var sett inn í vektorplasmíðið með fasta svæðisgeninu til að smíða einstofna mótefnatjáningarplasmíðið. Síðan er viðeigandi tjáningarkerfi (heilkjörnunga tjáningarkerfi eins og CHO frumur eða dreifkjörnunga tjáningarkerfi eins og Escherichia coli) valið til tjáningar og einstofna mótefnið með líffræðilegri virkni er fengið. Prótein A sækniskiljun var notuð til að vinna úr og hreinsa tjáðu mótefnin úr frumuræktun og fá hágæða endurröðuð einstofna mótefni.

Staðfesting mótefna

Staðfesting mótefna á sértækni, sækni og líffræðilegri virkni með ELISA, Western blot, flæðisgreiningu og ónæmissamfellingu til að tryggja að mótefnavirkni uppfyllti væntingar. Staðfesting mótefna er lykilatriði í að tryggja gæði og áreiðanleika mótefna.

Kröfur um ónæmisvaka

(1) Endurröðuð prótein: ≥2,5 mg, próteinhreinleiki >85%, próteinmólþungi meiri en 10 kDa, leysanlegur próteinþéttni á milli 0,5 og 5 mg/ml. Ef þörf er á hreinsun á sækni mótefnavaka þarf 10 mg til viðbótar af endurröðuðu próteini.

(2) Fjölpeptíð og smásameindir: Óblandað peptíð ≥10 mg, peptíðhreinleiki >90%, ekki minna en 10 AA, tengir KLH/BSA/OVA eða önnur burðarprótein; Smásameindir þurfa byggingarlegt mat fyrirfram.

Verkflæði fyrir flokkunarþjónustu fyrir stakar B-frumur

Skref	Þjónustuefni	Tímalína
Skref 1: Ónæmingu dýra og ELISA greining	(1) Dýrin voru bólusett 4-5 sinnum, frá og með fjórða skammti var sermi safnað til ELISA mælingar á mótefnatítra (prótein mótefnavaka ELISA sermitítra >10^5; peptíð mótefnavaka ELISA sermitítra >10^4). Á sama tíma eru 0,1 ml af forbólusetningar- og eftirbólusetningarsermi send til viðskiptavina til prófunar; Ef títerinn er ekki viðurkenndur mun bólusetningunni halda áfram eða viðskiptavinurinn óskar eftir að verkefninu verði hætt og aðeins bólusetningarhlutinn verður gjaldfærður; (2) Ef títerinn var staðfestur voru PBMC frumur einangraðar úr heilu blóði.	10-12 vikur
Skref 2: Flokkun einstakra B-frumna	(1) Milta var tekin, stakar B-frumur voru útbúnar, útlægt blóð var tekið og PBMC frumur voru einangraðar. (2) Ónæmisvakamerkin FITC og AF648. (3) Tvöföld flúrljómunarflæðisflokkun + ræktun á einni B-frumuklóni. (4) ELISA auðkenning + raðgreining jákvæðra klóna.	2-3 vikur
Skref 3: Mótefnaframleiðsla og staðfesting	(1) Myndun gena með 6-10 raðgreiningum + staðfesting á tjáningarprófi spendýra. (2) ELISA auðkenning.	3-4 vikur
Skref 4: Afhending	(1) Mótefnaraðir: 4-6 mótefnaraðir (ótjáðar raðir eru afhentar saman). (2) Hver tjáð röð afhenti 0,2 mg af mótefni. (3) Tilraunaskýrsla.	1 viku