Skimunarþjónusta fyrir yfirborðssýningu gerja

Alpha Lifetech sérhæfir sig í smíði og skimun á mótefnabókasöfnum fyrir ger og býður upp á möguleikann á að búa til mismunandi gerðir af gersöfnum og skima þau fyrir mótefni með mikla sækni og sértæka eiginleika fyrir viðskiptavini um allan heim. Með teymi sérfræðinga í rannsóknum, háþróaðri tækni og búnaði getum við smíðað gersöfn sem miða á fjölbreytt úrval sjúkdómstengdra próteina. Við getum boðið upp á tækni til að sýna ger, þar á meðal prótein í geri, smásameindageri, mótefnageri o.s.frv.

Sýningarbókasöfn okkar fyrir ger eru afar afkastamikil og fjölbreytt, sem veitir góðan grunn fyrir árangursríka skimun á sértækum mótefnaröðum. Við getum smíðað mismunandi gerðir af sýnibókasöfnum fyrir ger (IgG, scFv, VHH, Fab mótefnabókasöfn), próteinbókasöfn, peptíðbókasöfn, cDNA bókasöfn o.s.frv. eftir þörfum. Að auki getum við einnig þróað mótefnabókasöfn með ýmsum eiginleikum, þar á meðal ónæmisbókasöfn, náttúruleg bókasöfn, tilbúin bókasöfn, hálftilbúin bókasöfn og mótefnabókasöfn fyrir sjúkdóma.

Kynning á gersýningarkerfi

Yfirborðsbirting geris er aðferð til að birta endurröðuð prótein á yfirborði gers með genasamruna. Algengasta gerbirtingakerfið notar markpróteinið sem er samrunnið við C-enda Aga2p undireiningarinnar í alfa-lektín pörunarpróteininu, aðallega samanstendur af epitópmerkjum á báðum hliðum markpróteinsins: N-enda 9-amínósýru hemagglútínín (HA) merkið og C-enda 10 amínósýru c-myc merkið. 69 amínósýru Aga2p undireiningin binst 725 amínósýru alfa-lektín Aga1p undireiningunni í gegnum tvö tvísúlfíðtengi og Aga1p er fest við frumuvegginn í gegnum β 1,6-glúkan samgilt tengi. Þess vegna birtist markpróteinið á yfirborði gerfrumna og er síðan þekkt af samsvarandi bindli. Aðskiljið virk prótein frá bókasöfnum með flæðifrumusjá.

Mynd 1: Meginregla um yfirborðssýn gersins. (Heimild myndar: Notkun gersyfirborðsskjás fyrir próteinverkfræði.)

Kynning á yfirborðssýningarsafni gerja

Gersýnarflokkun byggist á yfirborðssýn gersins, aðallega notuð til að skima mótefnasöfn sem miða á yfirborðsprótein frumu. Vegna lágrar ósértækrar bindingar milli gerfrumna og annarra frumuyfirborða getur líffræðilegt val gersins skimað stór bindingarsöfn til að finna sjaldgæfa klóna.

Skimunarþjónusta fyrir yfirborðssýningu gerja

Útbúið plasmíð og ræktið gerfrumur, myndið DNA sem kóðar fyrir markpróteinið og klónið það í gertjáningarvigur sem inniheldur örvandi hvata, merkipeptíð og markgen sem eru sameinuð yfirborðssýnispróteinum (eins og Aga2p). Genið sem kóðar fyrir markpróteininu er hægt að sameina við genið sem kóðar fyrir frumuvegg gersins (venjulega Aga2p) og sameinuðu genið er hægt að umbreyta í gerfrumur með rafporeringu. Eftir umbreytingu geta gerfrumur sem tjá mótefnagen á yfirborði sínu gengist undir mótefnavakasértæk skimunarpróf: gersafnið er ræktað með markmótefnavakanum og gerfrumur sem bindast því sérstaklega eru valdar. Með því að nota flúrljómunarvirkjaða frumuröðun (FACS) til að einangra gerfrumur sem sýna prótein með tilætluðum eiginleikum er hægt að framkvæma skimun á gersýnisbókasafni með hámarksstærð bókasafns upp á ~10 ^ 8-10 ^ 9 gerfrumur. Jákvæðir klónar geta síðan verið einangraðir til frekari greiningar eða notkunar síðar. Þegar sértækir mótefnaklónar hafa verið greindir úr mótefnabókasafninu er hægt að einkenna þá frekar og fjöldaframleiða þá og hreinsa þá með aðferðum eins og prótein A/G sækniskiljun til að ljúka öllu ferlinu við gersýnisskimun og mótefnaframleiðslu.

Ferli skimunar á gersýningarbókasafni

Mynd 2. Skimunarferli gersýningarbókasafns

Vinnuflæði fyrir skimun á gersýningarbókasafni

Skref	Þjónustuefni	Tímalína
Undirbúningur mótefnavaka	Tegund mótefnavaka: Ef viðskiptavinurinn getur útvegað mótefnavaka þarf að afhenda samsvarandi sýni í samræmi við gerð: endurröðuð prótein þurfa 3-3,5 mg með hreinleikakröfu yfir 85%, smá sameindir þurfa að vera tengdar með hreinleikakröfu yfir 90%, peptíðmyndun þarf að vera tengd með hreinleikakröfu yfir 90%, sýnategundir eins og veirur þurfa að vera óvirkjaðar, RNA þarf að skoða til að koma í veg fyrir niðurbrot og einnig er hægt að aðlaga ofangreindar mótefnavakategundir fyrir myndun.	2-3 vikur
Ónæmi dýra	Fjöldi bólusetninga dýra er 5 og nauðsynlegt er að ákvarða hvort auka eigi fjölda bólusetninga út frá sermistítraprófum. Ónæmi mótefnavaka: styrkleiki próteina/veiru mótefnavaka > 105; styrkleiki peptíða/smásameinda mótefnavaka > 10^4	5-6 vikur
Undirbúningur sniðmáts cDNA	Aðskiljið PBMC frumur úr plasma, fjarlægið heildar-RNA (RNA útdráttarbúnaður) og snúið við í cDNA.	1 dagur
Bygging bókasafna	Með því að nota cDNA úr bókasafninu sem sniðmát var VHH genið magnað með tveimur PCR-umferðum og VHH genasplásunargersýnisvektor var smíðaður. Vigrinum var umbreytt í gerfrumur með rafporeringu til að smíða mótefnasafn. 48 klónar voru valdir af handahófi og jákvæða hlutfallið (>90%) greint með PCR-aðferðinni; Geymslurými bókasafnsins var reiknað út (10^7-10^8), síðan var NGS raðgreint til að ákvarða rétta innsetningarhlutfall bókasafnsins (>90%) og fjölbreytni bókasafnsins.	2 vikur
Sýning á bókasafni	Þrjár sjálfgefnar umferðir skimunar: Skimun með flúrljómunarmerktu próteini (FACS), síðan NGS raðgreining í þriðju umferð. Jákvæðir klónar voru valdir fyrir einstaka gramma örvunartjáningu og ELISA greiningu. Allir jákvæðir klónar voru valdir fyrir genaröðun og mismunandi CDR svæðisraðir voru valdar.	2-3 vikur
Staðfesting mótefna	Smíði viðeigandi tjáningarvigra fyrir mótefnaraðir getur auðveldað mótefnatjáningu, hreinsun mótefna, ELISA og BLI staðfestingu á bindingu mótefnavaka til að staðfesta sækni mótefna og hindrun flæðisfrumusjár til að staðfesta frumustarfsemi.	1 viku

Sýning á yfirborði geris á bókasafni

Í ritrýndum verkefnum um yfirborðsbirting gerja til að hraða uppgötvun byggingarlega sértækra nanólíkama, komu höfundarnir á fót heildstæðu in vitro vettvangi fyrir uppgötvun nanólíkama byggðan á yfirborðsbirtingum gerja. Í fyrsta lagi var tilbúið nanólíkamasafn hannað út frá úlfaldagenum. Mynd D sýnir að nanólíkaminn hefur HA merki á karboxýlendanum og síðan er nanólíkaminn festur með samgildum hætti á frumuvegg gersins. Mynd E sýnir skimunarferlið fyrir nanólíkama. Ger með mótefnavaka-sækni nanólíkama voru einangruð, magnað og endurtekið valin fyrir mótefni með FACS. Höfundarnir uppgötvuðu byggingarlega sértæka nanólíkama sem miðuðu á tvær mismunandi GPCR-sameindir manna í gegnum þennan vettvang.