Piattaforma per l'immunizzazione degli animali

Alpha Lifetech si avvale di fonti animali trasparenti, dotate di permessi di ispezione e quarantena, con un background genetico chiaro, una frequenza di immunizzazione definita e registrazioni dettagliate degli intervalli di immunizzazione, offrendo servizi efficienti per la produzione di anticorpi. L'azienda immunizza principalmente animali della famiglia Camelidae (alpaca, liama e cammelli), ponendo le basi per la produzione di nanocorpi. Inoltre, è in grado di immunizzare anche animali comuni (come conigli bianchi della Nuova Zelanda, topi e altri animali) in base alla frequenza di immunizzazione e ai requisiti di immunogenicità richiesti dai clienti, estrarre e isolare i PBMC (cellule mononucleate del sangue periferico) e utilizzarli per esperimenti successivi (come lo sviluppo di anticorpi monoclonali, policlonali, ecc.). I clienti possono fornire i propri immunogeni, sui quali effettueremo un rigoroso controllo di qualità. Qualora i clienti forniscano immunogeni virali, questi dovranno essere inattivati e noi effettueremo test di inattivazione per garantirne la sicurezza. Allo stesso tempo, possiamo anche personalizzare gli immunogeni in base alle esigenze del cliente.

Introduzione all'immunizzazione animale

Nella produzione di anticorpi derivati da animali, come anticorpi monoclonali, policlonali e nanocorpi, il primo passo consiste nell'immunizzare gli animali e ottenere le corrispondenti cellule B, anticorpi o PBMC (cellule mononucleate del sangue periferico) per prepararsi alla successiva produzione di anticorpi, promuovere la ricerca scientifica di base, sviluppare strumenti diagnostici clinici e facilitare la scoperta e lo sviluppo di nuovi farmaci. Cammelli, alpaca, Liama e altri camelidi possono produrre librerie di nanocorpi (anticorpi a dominio singolo) attraverso la raccolta di sangue immune ed l'estrazione di PBMC. Conigli e altri animali possono essere immunizzati e gli anticorpi possono essere estratti dai loro corpi. Dopo la purificazione, possono essere utilizzati per produrre anticorpi policlonali. Topi, ratti, ecc. possono essere utilizzati per produrre anticorpi monoclonali fondendo le cellule B immunizzate estratte con cellule di mieloma. Prima dell'immunizzazione, è necessario prestare attenzione ai principi delle 3R (sostituzione, riduzione, perfezionamento), che possono ridurre significativamente il numero di animali utilizzati al minimo necessario, migliorare le procedure sperimentali e minimizzare la sofferenza degli animali. È inoltre necessario attenersi a una corretta progettazione sperimentale, alla selezione di anticorpi appropriati e a rigorose procedure di validazione.

Classificazione degli immunogeni - produzione di nanocorpi

Tipi di immunogeni	Esempio	Preparazione dell'immunogeno	Note
Proteine immunogene	Enzimi, proteine, tossine batteriche e altre sostanze	Scegli diversi sistemi di espressione proteica: E. coli, lievito, cellule di insetto, cellule di mammifero e sistema acellulare.	Presta attenzione a fattori quali temperatura, tempo, pH e corpi di inclusione che influenzano l'espressione proteica.
Immunogeni degli acidi nucleici	DNA, RNA	Immunogeno del DNA: Costruire il DNA plasmidico, clonare vettori di espressione adatti per i geni bersaglio, coltivare le cellule per amplificare il DNA plasmidico ed estrarre il DNA plasmidico ad elevata purezza. Immunogeno a RNA: è necessario aggiungere una struttura a cappello e una coda di poliA per prevenire la degradazione.	Nella preparazione di immunogeni a base di DNA, occorre prestare attenzione alle cellule ospiti appropriate, mentre nella preparazione di immunogeni a base di RNA, occorre prestare attenzione a prevenire la degradazione dell'RNA.
Immunogeni virali	Vaccino inattivato a virus intero, vaccino a subunità, vaccino a vettore virale (adenovirus, lentivirus, ecc.), vaccino mRAN.	Nella preparazione di un vaccino a virus intero inattivato, il virus viene prima inattivato per aumentarne la sicurezza. I test di tossicità vengono utilizzati per determinare se l'inattivazione è completa. I vaccini a subunità richiedono come antigeni solo le proteine di superficie del virus e devono quindi tenere conto dell'efficacia immunitaria.	È necessario aggiungere adiuvanti per ottenere effetti immunitari, bisogna prestare attenzione al virus da inattivare, sono richiesti titoli virali adeguati per garantire gli effetti immunitari e la sicurezza del processo di preparazione deve essere rigorosamente controllata.

Processo o tempistica di immunizzazione degli animali

Selezione degli animali e preparazione dell'antigene

Selezione degli animali: Selezionare alpaca di età adeguata e di buona salute da gruppi sani, ed effettuare esami del sangue e screening per accertarsi che non vi siano malattie infettive o altri problemi di salute.

Preparazione degli immunogeni: Gli immunogeni sono fondamentali per indurre risposte immunitarie e richiedono la selezione di proteine, peptidi o altre sostanze idonee in base alle esigenze dell'anticorpo bersaglio.

Un alpaca può essere immunizzato simultaneamente con 1-3 antigeni, per una quantità totale di antigene di 1-2 mg per immunizzazione e un volume inferiore a 2 mL. Prima dell'immunizzazione, l'antigene e l'adiuvante vengono emulsionati in rapporto 1:1 per formare una miscela omogenea, che viene conservata a 4 °C.

Alpaca immunologico

Annotare il numero dell'orecchio dell'alpaca e iniziare l'esperimento di immunizzazione. Iniettare nei linfonodi vicino al collo dell'alpaca su entrambi i lati, con 2 punti per lato e circa 0,4 ml di antigene emulsionato iniettato in ogni punto. Dopo l'immunizzazione, osservare per mezz'ora per verificare che l'alpaca non presenti sintomi di malessere. L'immunizzazione deve essere somministrata ogni 2 settimane, per un minimo di 4 immunizzazioni.

prelievo di sangue

Dopo 4 vaccinazioni a distanza di 5-7 giorni, prelevare 50 ml di sangue dalla vena del collo dell'alpaca.

Separazione del siero

Prima di ogni immunizzazione antigenica, vengono prelevati campioni di sangue per la valutazione immunologica, con un prelievo di 5 ml ogni volta. Lo stesso giorno, il sangue viene centrifugato a 400 xg per 30 minuti utilizzando una centrifuga preraffreddata a 25 °C. Lo strato superiore di siero viene separato e conservato per il successivo test del titolo anticorpale.

Linfociti separati

Innanzitutto, aggiungere 15 ml di soluzione per la separazione cellulare, quindi aggiungere lentamente 15 ml di sangue in una provetta da centrifuga da 50 ml. Prestare attenzione e procedere lentamente durante l'aggiunta del sangue per evitare la miscelazione con la soluzione di separazione. Centrifugare preraffreddata a 25 °C, centrifugare a 400 xg per 30 minuti e conservare il siero superiore in una nuova provetta da centrifuga a -80 °C; utilizzare una pipetta per aspirare le cellule immunitarie dello strato superiore centrale, a forma di batuffolo di cotone, in una nuova provetta da centrifuga da 50 ml. Aggiungere 10 ml di tampone PBS a temperatura ambiente a ciascuna provetta, centrifugare a 25 °C e 400 xg per 20 minuti. Rimuovere il supernatante, aggiungere 5 ml di tampone PBS a temperatura ambiente a ciascuna provetta, mescolare delicatamente, calcolare il numero di cellule utilizzando un emocitometro e quindi centrifugare a 25 °C e 400 xg per 20 minuti. Rimuovere il supernatante e sciogliere i linfociti ottenuti con RNAiso Plus in base al numero di cellule per ottenere un lisato cellulare di 10^7/mL, che viene conservato a -80 ℃.

Figura 1: Rappresentazione schematica di diverse strategie di scoperta di anticorpi e delle fasi sperimentali coinvolte. (Fonte della figura: Laustsen, Andreas H. et al.)

I clienti forniscono immunogeni con un rigoroso controllo di qualità.

Tipi di immunogeni	Requisito	Metodo di controllo qualità
Campioni di peptidi/piccole molecole	Condizioni di dissoluzione (principalmente a seconda che inattivino o meno i fagi), struttura molecolare/sequenza peptidica, rapporto di sintesi (HPLC/MS/HNMR)	Rilevamento HPLC/MS
Campioni di proteine	SDS-PAGE/WB, condizioni di ricostituzione, tampone, informazioni sull'etichetta, quantità totale (20-50 µg), concentrazione, purezza, ecc.	SDS-PAGE/WB
Campioni cellulari	Tipo di cellula (cellule primarie/cellule geneticamente modificate), forma cellulare (fresca/congelata scongelata), tipo di crescita (aderente/sospesa), requisiti del terreno di coltura, numero di cellule fornite, numero di cellule fornite, cellule geneticamente modificate per garantire l'espressione stabile dei target di screening (anticorpo primario corrispondente al cliente), cellule congelate scongelate per determinare il tasso di recupero	Ci rivolgiamo principalmente a cellule geneticamente modificate, utilizzando anticorpi primari forniti dal cliente per l'identificazione dell'espressione del target tramite ELISA (la nostra azienda fornisce anticorpi secondari HRP) e rilevamento mediante citometria a flusso (la nostra azienda può fornire anticorpi secondari fluorescenti).

Quali sono le applicazioni dell'immunità animale?

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Gli anticorpi policlonali possono essere prodotti mediante immunizzazione di animali, gli anticorpi monoclonali possono essere prodotti mediante fusione di cellule B con cellule del mieloma e le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) possono essere estratte da fonti di origine cammelliera (alpaca, cammello, ecc.) per produrre varie forme di frammenti anticorpali come nanocorpi, frammenti Fab, frammenti anticorpali scFv, ecc.
Quali sono le precauzioni da adottare per rafforzare l'immunità degli animali?

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Per produrre nanoanticorpi per animali derivati dal cammello, sono necessarie 5-6 immunizzazioni. Prima dell'immunizzazione, è necessario prelevare campioni di sangue come controllo, con un intervallo di 2 settimane tra un'immunizzazione e l'altra. Dopo la quarta immunizzazione, è necessario prelevare campioni di sangue positivi e negativi da animali non immunizzati per l'analisi ELISA al fine di determinare il titolo anticorpale. Se il titolo è inferiore a 10^6, il numero di immunizzazioni deve essere aumentato fino al raggiungimento di un livello adeguato. Per altre immunizzazioni animali, come l'immunizzazione dei conigli (il livello ottimale o comune di antigene proteico per l'immunizzazione dei conigli è di 50-1000 µg), l'immunizzazione dei topi (il livello ottimale o comune di antigene proteico per l'immunizzazione dei topi è di 5-50 µg, che richiede 10^6 cellule se si tratta di cellule, e 10-50 µg per acidi nucleici o carboidrati), l'immunizzazione delle capre (il livello ottimale o comune di antigene proteico per l'immunizzazione delle capre è di 250-5000 µg), ecc., è necessario prestare attenzione al dosaggio, alla sicurezza e all'efficacia degli immunogeni.
Come scegliere animali immuni?

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A seconda del tipo di anticorpo richiesto dal cliente, se è necessario produrre nanocorpi o altri frammenti di anticorpi, è possibile scegliere animali derivati dai cammelli (cammello, alpaca) per l'immunizzazione. Se è necessario produrre anticorpi monoclonali o policlonali, è necessario selezionare la specie corrispondente in base alla quantità di siero, antigene e fonte di antigene. La quantità massima di siero per i conigli è di 500 ml, il che richiede una bassa quantità di antigene ed è la scelta principale per la produzione di anticorpi policlonali. La quantità massima di siero per i topi è di 2 ml e la quantità massima di siero per i ratti è di 20 ml, che di solito è la scelta ottimale per gli anticorpi monoclonali. Gli anticorpi prodotti dalle capre hanno un'elevata affinità e Alpha Lifetech può personalizzare un piano di immunizzazione esclusivo in base alle vostre esigenze.
È necessario utilizzare gli antigeni insieme agli adiuvanti? Come scegliere?

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Esistono due tipi di adiuvanti: a base oleosa e a base acquosa. Un uso appropriato degli adiuvanti è fondamentale per indurre una forte risposta anticorpale agli antigeni solubili. Il rilascio prolungato degli adiuvanti consente di utilizzare dosi inferiori di antigene e di ottenere risposte anticorpali più durature. La prima iniezione dovrebbe essere somministrata in combinazione con un adiuvante. Generalmente si raccomanda l'uso dell'adiuvante di Freund quando la quantità di immunogeno è ridotta.
Precauzioni da adottare per la vaccinazione degli alpaca?

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(1) La selezione dell'alpaca e dell'antigene dell'immunità è fondamentale per una immunizzazione efficace. Non è consigliabile scegliere un cammello ben proporzionato. La purezza e la corretta conformazione degli antigeni immunitari sono cruciali per lo screening di anticorpi adatti per applicazioni successive all'immunizzazione con alpaca. La purezza degli antigeni proteici non è generalmente inferiore al 90%.

(2) Separazione dei linfociti: una separazione cellulare tempestiva può prevenire efficacemente l'emolisi dopo il prelievo del sangue per ottenere il miglior effetto di separazione.

(3) Il ciclo immunitario può influenzare la risposta immunitaria: un intervallo immunitario di 1-2 settimane consente agli alpaca di avere una buona risposta immunitaria alla maggior parte degli antigeni.

adiuvante sviluppato in modo indipendente

La nostra formula esclusiva di adiuvante è stata ottimizzata per il sistema immunitario dell'alpaca, garantendo maggiore potenza e specificità rispetto agli adiuvanti tradizionali.

Somministrazione di vaccini
standard

Ci impegniamo a completare l'immunizzazione entro i tempi previsti, a fornire siero ad alto titolo e a documentare ogni fase tramite report dettagliati.

Controllo qualità del progetto

Ogni progetto è sottoposto a rigorosi processi di controllo qualità per garantire la fornitura di anticorpi che soddisfino elevati standard ai clienti.

chiaramenteAlpacaSfondo

Disponiamo di una popolazione di alpaca sana che fornisce supporto a diversi programmi di immunizzazione.

Per qualsiasi domanda, non esitate a contattarci in qualsiasi momento.

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