La tecnologia del phage display consiste nell'inserire il gene bersaglio estraneo nella posizione specifica della proteina del capside del fago, esprimendo il gene estraneo sulla superficie del fago senza comprometterne la normale funzione. Dopo diversi cicli di screening, è stata finalmente ottenuta la proteina bersaglio con elevata specificità e alta attività biologica.

Grazie a questa tecnologia è possibile generare librerie di anticorpi ad alta capacità. Il ciclo di screening è breve, il processo operativo è semplice e la gamma di applicazioni è ampia, consentendo l'identificazione di sequenze ottimali per peptidi o proteine ​​bersaglio. Nelle applicazioni relative ai virus, i ricercatori possono scoprire anticorpi che si legano a epitopi virali cruciali attraverso lo screening di ampie librerie di anticorpi. Questo processo può ostacolare l'ingresso, la replicazione o i meccanismi di evasione immunitaria dei virus, ponendo così le basi per il trattamento delle malattie.

La tecnologia del phage display è più ampiamente utilizzata rispetto alla tecnologia degli ibridomi, che è limitata alla produzione di una piccola quantità di anticorpi contro specifici immunogeni. Al contrario, la tecnologia del phage display può presentare un'intera libreria di anticorpi derivati ​​da diverse specie immunitarie.

La tecnologia del phage display ha una vasta gamma di applicazioni, tra cui lo screening dei recettori dei microrganismi patogeni, lo studio delle interazioni proteiche, il monitoraggio della trasmissione del segnale tra le cellule, la diagnosi di malattie animali e lo sviluppo di vaccini, solo per citarne alcuni.

La tecnologia del phage display offre numerosi vantaggi e può essere applicata in diversi campi. Tuttavia, la principale sfida nello sviluppo di anticorpi ricombinanti mediante il metodo del phage display risiede nella complessità e nei costi associati al processo. Questo approccio richiede l'integrazione di tecniche di biologia molecolare, tra cui mutazione, clonazione ed espressione, insieme ad analisi immunologiche, biochimiche e biofisiche per identificare e caratterizzare gli anticorpi desiderati.

La presentazione dell'antigene è un passaggio fondamentale. I metodi principali di presentazione dell'antigene includono la presentazione diretta tramite rivestimento, la presentazione indiretta tramite rivestimento, la presentazione dell'antigene attraverso lo screening di cellule intere, la presentazione dell'antigene tramite liposomi, dischi di nanofosfolipidi e VLP.

Il metodo di rivestimento diretto è relativamente semplice, ma la conformazione dell'antigene si modifica facilmente, mentre l'operazione di rivestimento indiretto è complessa, ma può mantenere la conformazione dell'antigene e migliorare l'efficienza di presentazione. Lo screening cellulare può simulare la scena reale in vivo, ma presenta il problema del legame non specifico. Il disco di nanofosfolipidi ha dimensioni ridotte, elevata efficienza di rilascio e buona stabilità; le VLP sono fuse con l'antigene o avvolte con l'antigene, il che comporta un'elevata immunogenicità e una buona sicurezza, e può innescare una forte risposta immunitaria.

Se la concentrazione è troppo bassa, la probabilità di legame con il fago diminuirà, con conseguente riduzione dell'efficienza dello screening. Al contrario, una concentrazione eccessivamente elevata può aumentare la probabilità di legame non specifico, incrementare il segnale di fondo e ostacolare l'identificazione dei cloni positivi.

È possibile adottare un metodo di fissaggio delicato per evitare alte temperature, acidi e alcali forti. Il metodo di rivestimento indiretto e il sistema biotina-streptavidina sono stati utilizzati per ridurre i danni alla struttura dell'antigene. Se l'antigene è una proteina di membrana, può essere esposto sulla superficie di cellule intatte o utilizzato per simulare l'ambiente della membrana, come ad esempio un nanodisco, per mantenere la sua conformazione naturale di proteina di membrana.

Oltre agli esperimenti di routine come ELISA, Western Blotting (WB) e immunofluorescenza (IF), le tecniche di rilevamento basate sulla risonanza plasmonica di superficie (SPR) e sull'interferometria a strato biologico (BLI) possono essere impiegate per monitorare in tempo reale i processi di legame e dissociazione di anticorpi e antigeni, consentendo la determinazione dei parametri di affinità e cinetici.

La tecnica del phage display può essere utilizzata per generare anticorpi monoclonali ad alta affinità per una vasta gamma di specie produttrici di anticorpi, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, esseri umani, topi, ratti, conigli, polli, cammelli, alpaca, bovini, cani, pecore, scimmie e squali.

La tecnologia di costruzione di librerie di anticorpi murini è consolidata, economicamente vantaggiosa e richiede tempi sperimentali brevi, risultando quindi adatta allo screening preliminare degli anticorpi e alla ricerca di base. Gli anticorpi di coniglio mostrano un'elevata affinità e specificità, con un più ampio spettro di riconoscimento degli epitopi rispetto agli anticorpi murini. Gli anticorpi umani possono essere ottenuti direttamente da librerie di anticorpi umani, evitando così potenziali reazioni immunitarie che potrebbero verificarsi con la somministrazione di anticorpi eterologhi all'organismo umano. Questo approccio riveste un'importanza significativa nella ricerca e nello sviluppo di farmaci, in particolare nella creazione di anticorpi terapeutici.

Gli immunogeni animali sono generalmente suddivisi in antigeni proteici, antigeni polipeptidici, antigeni degli acidi nucleici e antigeni correlati ai patogeni, tra i quali questi ultimi includono antigeni virali (particelle virali complete, proteine ​​virali, proteine ​​non strutturali virali, ecc.), antigeni batterici (estratto batterico completo, componenti della parete cellulare, proteine ​​secrete, tossine, ecc.) e antigeni parassitari.

Modificare gli immunogeni sostituendo gli antigeni immunitari con proteine ​​ricombinanti e rimpiazzando le particelle virali responsabili della risposta immunitaria con le proteine ​​strutturali dei virus. Modificare il disegno sperimentale e il dosaggio dell'immunogeno.

L'immunogenicità può essere potenziata legando gli antigeni a proteine ​​vettrici, come l'albumina sierica bovina. Inoltre, si possono utilizzare adiuvanti immunologici, tra cui l'adiuvante di Freund e l'adiuvante a base di alluminio, per prolungare il tempo di permanenza in vivo e stimolare l'attivazione e la proliferazione delle cellule immunitarie, migliorando così l'immunogenicità.

Una libreria di anticorpi fagici è una collezione di diversi anticorpi fagici creata assemblando un set completo di geni della regione variabile degli anticorpi in vettori fagici ed esprimendoli sulla superficie dei fagi. Questo processo porta alla formazione di una libreria di anticorpi fagici.

Il processo generale di phage display prevede diverse fasi chiave: estrazione di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da animali immunizzati, isolamento dell'RNA totale e sua trascrizione in DNA complementare (cDNA), amplificazione del gene bersaglio mediante la tecnologia della reazione a catena della polimerasi (PCR), clonazione del gene bersaglio in un vettore fagico e trasformazione del vettore in una cellula ospite per l'espressione. Questo processo porta alla costruzione di una libreria di phage display, che può identificare rapidamente anticorpi ad alta affinità. Successivamente, questa libreria può rappresentare una risorsa preziosa per lo sviluppo di vaccini, farmaci terapeutici e reagenti diagnostici.

In base alla fonte della libreria di anticorpi, le librerie di anticorpi fagici possono essere classificate in librerie di anticorpi fagici immuni e librerie di anticorpi fagici nativi. La principale distinzione tra questi due tipi risiede nel fatto che gli animali siano stati vaccinati o meno. Inoltre, le librerie di anticorpi nativi possono essere generate tramite semisintesi o sintesi.

Esistono due indici principali per valutare la qualità di una libreria di anticorpi: la capacità di archiviazione e la diversità. Un'elevata capacità di archiviazione, combinata con un'alta diversità, garantisce uno screening efficace di anticorpi con elevata affinità e specificità.

Nel processo di elutriazione biologica, la libreria di molecole esposte viene incubata con target fissi e quindi lavata accuratamente per rimuovere i fagi non reattivi. I coniugati vengono tipicamente eluiti utilizzando una soluzione acida o ad alta concentrazione salina e successivamente amplificati in cellule ospiti idonee per l'arricchimento. Dopo 3-5 cicli di screening, si ottengono anticorpi ad alta affinità.

I metodi di screening dei fagi includono principalmente il panning in fase solida, lo screening in fase liquida e lo screening cellulare. La scelta del metodo di screening più appropriato deve tenere conto delle caratteristiche delle molecole bersaglio, degli obiettivi del processo di screening e dell'ambiente di laboratorio.

Lo screening positivo è il metodo fondamentale per la selezione di anticorpi fagici che si legano a proteine ​​bersaglio. Lo screening negativo serve a eliminare gli anticorpi non specifici. Durante il processo di screening degli anticorpi fagici, possono essere identificati anticorpi non specifici a causa di interferenze da parte dell'antigene bersaglio, di materiali o di altri antigeni con somiglianze strutturali con l'antigene bersaglio. In questi casi, lo screening negativo può migliorare l'efficienza del processo di screening.

I metodi per la verifica degli anticorpi includono in genere ELISA, Western Blotting (WB), citometria a flusso, immunoprecipitazione (IP), immunofluorescenza (IF), immunoistochimica e varie altre tecniche sperimentali. Alpha Lifetech vanta una vasta esperienza nel rilevamento degli anticorpi e dispone di un team di esperti che garantisce l'efficacia degli anticorpi negli esperimenti successivi.