La tecnologia "phage display" consiste nell'inserire il gene bersaglio estraneo nella posizione specifica della proteina del capside del fago ed esprimerlo sulla superficie del fago senza comprometterne la normale funzione. Dopo diversi cicli di screening, è stata finalmente ottenuta la proteina bersaglio con elevata specificità ed elevata attività biologica.

Questa tecnologia consente di generare librerie di anticorpi ad alta capacità. Il ciclo di screening è breve, il processo operativo è semplice e la gamma di applicazioni è ampia, consentendo l'identificazione di sequenze ottimali per peptidi o proteine ​​mirati. Nelle applicazioni virali, i ricercatori possono scoprire anticorpi che si legano a epitopi virali critici mediante lo screening di ampie librerie di anticorpi. Questo processo può impedire l'ingresso, la replicazione o i meccanismi di evasione immunitaria dei virus, gettando così le basi per il trattamento della malattia.

La tecnologia del phage display è più ampiamente utilizzata rispetto alla tecnologia dell'ibridoma, che si limita a produrre una piccola quantità di anticorpi contro immunogeni specifici. Al contrario, la tecnologia del phage display può presentare un'intera libreria di anticorpi derivati ​​da diverse specie immunitarie.

La tecnologia Phage display ha un'ampia gamma di applicazioni, tra cui lo screening dei recettori dei microrganismi patogeni, lo studio delle interazioni proteiche, il monitoraggio della trasmissione del segnale tra le cellule, la diagnosi delle malattie animali e lo sviluppo di vaccini, tra gli altri campi.

La tecnologia del phage display offre numerosi vantaggi e può essere applicata in diversi campi. Tuttavia, la sfida principale nello sviluppo di anticorpi ricombinanti utilizzando il metodo del phage display è la complessità e i costi associati al processo. Questo approccio richiede l'integrazione di tecniche di biologia molecolare, tra cui mutazione, clonazione ed espressione, insieme ad analisi immunologiche, biochimiche e biofisiche per identificare e caratterizzare gli anticorpi desiderati.

La presentazione dell'antigene è un collegamento molto importante. I metodi di presentazione dell'antigene includono principalmente la presentazione diretta dell'antigene rivestito, la presentazione indiretta dell'antigene rivestito, la presentazione dell'antigene tramite screening cellulare, la presentazione dell'antigene tramite liposomi, dischi nanofosfolipidici e VLP.

Il metodo di rivestimento diretto è relativamente semplice, ma la conformazione dell'antigene è facile da modificare, mentre l'operazione di rivestimento indiretto è complicata, ma può mantenere la conformazione dell'antigene e migliorare l'efficienza di presentazione. Lo screening cellulare può simulare la scena reale in vivo, ma presenta un problema di legame aspecifico. Il disco nano-fosfolipidico ha dimensioni ridotte, elevata efficienza di rilascio e buona stabilità; le VLP sono fuse con l'antigene o avvolte con l'antigene, il che presenta elevata immunogenicità e buona sicurezza e può innescare una forte risposta immunitaria.

Se la concentrazione è troppo bassa, la probabilità di legame con il fago diminuirà, con conseguente riduzione dell'efficienza dello screening. Al contrario, una concentrazione eccessivamente elevata può aumentare la probabilità di legame aspecifico, elevare il segnale di fondo e ostacolare l'identificazione dei cloni positivi.

È possibile adottare un metodo di fissaggio delicato per evitare alte temperature, acidi forti e basi. Il metodo di rivestimento indiretto e il sistema biotina-streptavidina sono stati utilizzati per ridurre il danno alla struttura dell'antigene. Se l'antigene è una proteina di membrana, può essere esposto sulla superficie di cellule intatte o utilizzato per simulare l'ambiente di membrana, come un nanodisco, per mantenere la sua conformazione proteica di membrana naturale.

Oltre agli esperimenti di routine come ELISA, Western Blotting (WB) e immunofluorescenza (IF), è possibile impiegare tecniche di rilevamento come la risonanza plasmonica di superficie (SPR) e l'interferometria a strati biologici (BLI) per monitorare in tempo reale i processi di legame e dissociazione di anticorpi e antigeni, consentendo la determinazione di parametri di affinità e cinetici.

Il phage display può essere utilizzato per generare anticorpi monoclonali ad alta affinità per un'ampia gamma di specie produttrici di anticorpi, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, esseri umani, topi, ratti, conigli, polli, cammelli, alpaca, mucche, cani, pecore, scimmie e squali.

La tecnologia di costruzione di librerie di anticorpi murini è consolidata, economica e ha una breve durata sperimentale, il che la rende adatta allo screening preliminare di anticorpi e alla ricerca di base. Gli anticorpi di coniglio mostrano elevata affinità e specificità, con un intervallo di riconoscimento degli epitopi più ampio rispetto agli anticorpi murini. Gli anticorpi umani possono essere ottenuti direttamente dalle librerie di anticorpi umani, evitando così potenziali reazioni immunitarie che possono verificarsi quando anticorpi eterologhi vengono somministrati al corpo umano. Questo approccio ha un valore significativo nella ricerca e nello sviluppo di farmaci, in particolare nella creazione di anticorpi terapeutici.

Gli immunogeni animali sono generalmente suddivisi in antigene proteico, antigene polipeptidico, antigene dell'acido nucleico e antigene correlato al patogeno, tra cui l'antigene correlato al patogeno comprende l'antigene virale (particella virale completa, proteina virale, proteina non strutturale del virus, ecc.), l'antigene batterico (estratto batterico completo, componente della parete cellulare, proteina secreta, tossina, ecc.) e l'antigene parassitario.

Regolare gli immunogeni sostituendo gli antigeni immunitari con proteine ​​ricombinanti e sostituendo le particelle virali con le proteine ​​strutturali dei virus. Adattare il disegno sperimentale e modificare il dosaggio immunitario.

L'immunogenicità può essere potenziata accoppiando gli antigeni a proteine ​​carrier, come l'albumina sierica bovina. Inoltre, adiuvanti immunitari, tra cui l'adiuvante di Freund e l'adiuvante di alluminio, possono essere impiegati per prolungare il tempo di residenza in vivo e stimolare l'attivazione e la proliferazione delle cellule immunitarie, migliorando così l'immunogenicità.

Una libreria di anticorpi fagici è una raccolta di diversi anticorpi fagici creati assemblando un set completo di geni a regione variabile da anticorpi in vettori fagici ed esprimendoli sulla superficie dei fagi. Questo processo porta alla formazione di una libreria di anticorpi fagici.

Il processo generale del phage display prevede diversi passaggi chiave: estrazione di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da animali immunizzati, isolamento dell'RNA totale e sua trascrizione in DNA complementare (cDNA), amplificazione del gene bersaglio mediante reazione a catena della polimerasi (PCR), clonazione del gene bersaglio in un vettore fagico e trasformazione del vettore in una cellula ospite per l'espressione. Questo processo si traduce nella costruzione di una libreria di phage display, in grado di identificare rapidamente anticorpi ad alta affinità. Successivamente, questa libreria può rappresentare una risorsa preziosa per lo sviluppo di vaccini, farmaci terapeutici e reagenti diagnostici.

In base alla fonte della libreria anticorpale, le librerie anticorpali fagiche possono essere classificate in librerie anticorpali fagiche immunitarie e librerie anticorpali fagiche native. La distinzione principale tra queste due tipologie risiede nel fatto che gli animali siano stati vaccinati o meno. Inoltre, le librerie anticorpali native possono essere generate tramite semi-sintesi o sintesi.

Esistono due indici principali per valutare la qualità di una libreria di anticorpi: capacità di stoccaggio e diversità. Un'ampia capacità di stoccaggio, combinata con un'elevata diversità, garantisce uno screening efficace di anticorpi con elevata affinità e specificità.

Nel processo di elutriazione biologica, la libreria di visualizzazione viene incubata con target fissati e quindi ampiamente lavata per rimuovere i fagi non reattivi. I coniugati vengono in genere eluiti utilizzando una soluzione acida o ad alto contenuto salino e successivamente amplificati in cellule ospiti idonee per l'arricchimento. Dopo 3-5 cicli di screening, si ottengono anticorpi ad alta affinità.

I metodi di screening fagico includono principalmente il panning in fase solida, lo screening in fase liquida e lo screening cellulare. La scelta del metodo di screening appropriato dovrebbe tenere conto delle caratteristiche delle molecole target, degli obiettivi del processo di screening e dell'ambiente di laboratorio.

Lo screening positivo è il metodo più fondamentale per lo screening degli anticorpi fagici che si legano alle proteine ​​bersaglio. Lo screening negativo serve a eliminare gli anticorpi aspecifici. Durante il processo di screening degli anticorpi fagici, gli anticorpi aspecifici possono essere identificati a causa dell'interferenza con l'etichetta dell'antigene bersaglio, con i materiali o con altri antigeni con somiglianze strutturali con l'antigene bersaglio. In questi casi, lo screening negativo può migliorare l'efficienza del processo di screening.

I metodi per la verifica degli anticorpi includono tipicamente ELISA, Western Blotting (WB), citometria a flusso, immunoprecipitazione (IP), immunofluorescenza (IF), immunoistochimica e varie altre tecniche sperimentali. Alpha Lifetech vanta una vasta esperienza nella rilevazione degli anticorpi e dispone di un team sperimentale professionale, che garantisce l'efficacia degli anticorpi negli esperimenti successivi.