Piattaforma di sviluppo per l'umanizzazione degli anticorpi

Gli anticorpi umanizzati innescano una risposta minima o nulla da parte del sistema immunitario umano. Secondo Cognitive Market Research, il mercato globale dell'umanizzazione degli anticorpi raggiungerà i 92,5 milioni di dollari nel 2024 e si espanderà a un tasso di crescita annuo composto (CAGR) del 13,00% dal 2024 al 2031. Alpha Lifetech dispone di una piattaforma di umanizzazione di anticorpi matura, con un tasso di successo superiore al 98%. Disponiamo di diverse strategie di umanizzazione, tra cui innesto CDR, innesto SDR, mescolamento di catene, phage display, ecc., che possono essere selezionate in base alle vostre esigenze sperimentali. Possiamo fornire non solo l'umanizzazione di anticorpi provenienti da diverse specie, come topi, conigli, alpaca, cammelli, ecc., ma anche l'umanizzazione di anticorpi in varie forme, come scFv, Fab e nanobodies. Disponiamo di personale tecnico professionale per fornire servizi di produzione, purificazione e validazione di anticorpi, tra cui la produzione di anticorpi monoclonali murini, la produzione di anticorpi chimerici, l'espressione e la purificazione di anticorpi umanizzati, nonché la caratterizzazione e l'analisi di anticorpi umanizzati. Garantiamo la produzione di anticorpi umanizzati con un elevato tasso di successo, elevata purezza e bassa immunogenicità.

Introduzione all'umanizzazione degli anticorpi

La terapia con anticorpi monoclonali può essere utilizzata per il trattamento di malattie autoimmuni, cancro e altre patologie. Gli anticorpi monoclonali vengono prodotti immunizzando topi o altri animali. Quando vengono utilizzati per trattare malattie nella fase avanzata della produzione di anticorpi monoclonali, l'immunogenicità degli anticorpi non umani non può essere ignorata. Il principio fondamentale dell'umanizzazione è quello di integrare residui strutturali non umani, come le regioni ipervariabili determinanti la complementarietà (CDR), nella struttura umana, producendo sequenze che mantengono le caratteristiche anticorpali originali prevenendone l'immunogenicità. L'immunizzazione del topo e la successiva umanizzazione della sequenza murina rimangono due dei principali percorsi per la scoperta di anticorpi terapeutici, che attraversano principalmente diverse fasi: produzione di anticorpi murini, chimerizzazione dell'anticorpo monoclonale, anticorpo monoclonale umano murino chimerico e processo di sviluppo di un anticorpo monoclonale completamente umanizzato. Attualmente, la ricerca comprende principalmente topi transgenici (trasferimento di geni di cellule B umane nei topi), screening ad alto rendimento mediante tecnologia di visualizzazione di lieviti o fagi, innesto di CDR (inserimento di CDR parentali in sequenze umane), determinazione dei residui specifici del trapianto (SDR), mescolamento del framework e altri metodi.

umanizzazione degli anticorpi - Alpha Lifetech

Fig. 1: Panoramica schematica dell'umanizzazione degli anticorpi da anticorpi murini (domini verdi) ad anticorpi completamente umani.

Strategia di umanizzazione degli anticorpi

Innesto CDR

L'innesto CDR viene ottenuto tramite un sistema di espressione nei mammiferi basato sulla tecnologia del DNA ricombinante e i suoi passaggi principali sono:

(1) Sviluppare anticorpi corrispondenti nei topi (o in fonti non umane), isolare gli anticorpi che codificano il DNA e clonarli in vettori per il sequenziamento (o eseguire direttamente il sequenziamento di singole cellule).

(2) Per determinare la sequenza del DNA corrispondente al CDR dell'anticorpo e per determinare la specificità del legame del bersaglio;

(3) Selezionare la regione strutturale umana (FR) per trapiantare CDR non umani e costruire un nuovo gene anticorpale.

(4) Eseguire un'analisi tridimensionale dei conflitti tra CDR non umani e FR umani per generare mutazioni di recupero per stabilizzare il ciclo e prevenire la perdita di affinità o integrità strutturale dell'anticorpo umanizzato finale.

Fig. 2: Panoramica schematica dell'innesto della regione determinante la complementarietà (CDR).

Rimescolamento del framework

Il framework shuffling si basa sulla tecnologia di phage display e sulla tecnologia di screening delle librerie fagiche per ottenere anticorpi ad alta affinità. Gli oligonucleotidi che codificano per le catene pesanti degli anticorpi umani vengono utilizzati come stampi, le regioni CDR vengono codificate come primer e l'amplificazione tramite PCR viene eseguita per denaturare il prodotto di PCR e ottenere DNA a singolo filamento. Il DNA a singolo filamento dei geni VL e VH, purificato con streptavidina, viene ricostruito su vettori utilizzando la DNA ligasi T4 ed enzimi di restrizione, incubato con batteriofagi e amplificato da batteriofagi, quindi viene costruita una libreria di phage display. Vengono eseguiti tre cicli di screening con gli antigeni corrispondenti e i cloni positivi vengono infine verificati utilizzando ELISA e altri metodi.

Fig. 3: Illustrazione schematica delle strategie di umanizzazione dell'innesto della regione determinante la complementarietà (CDR) e del rimescolamento della struttura (FR). (A) La procedura principale dell'innesto CDR. (B) Il processo principale del rimescolamento FR. (Fonte di riferimento: Wang Yongmei et al., Confronto tra “framework shuffling” e “CDR grafting” nell’umanizzazione di un anticorpo murino PD-1.)

Visualizzazione dei fagi

La produzione di anticorpi umanizzati si basa sul metodo di esposizione di anticorpi specifici sulla superficie dei batteriofagi, costruiti principalmente attraverso librerie fagiche di anticorpi umani. La fonte della libreria sono i PBMC isolati dal sangue periferico umano per costruire librerie fagiche, da cui vengono selezionate le sequenze corrispondenti. Questa sequenza presenta la sequenza umana completa, ma gli anticorpi prodotti sono frammenti di anticorpi, come scFv, Fab e nanobody.

Flusso di lavoro del servizio di umanizzazione degli anticorpi

Fasi del servizio	Standard di controllo qualità	Cronologia
Isolamento degli anticorpi	Purezza >95%	1-2 settimane
Analisi di sequenza	Identificazione accurata di sequenze non umane	1 settimana
Innesto CDR e innesto Framework	Integrazione ed espressione di successo	2-3 settimane
Espressione e purificazione	Alta resa e purezza	2-3 settimane
Validazione funzionale	Valutazione di affinità e specificità	1 settimana

Vantaggi della piattaforma di umanizzazione degli anticorpi

Alpha Lifetech dispone di una piattaforma di umanizzazione degli anticorpi matura, con un tasso di successo superiore al 98% per gli anticorpi umanizzati.