Servizio di ricerca sugli aptameri
In base alle diverse esigenze di analisi dei clienti, Alpha Lifetech offre una varietà di strategie di analisi degli aptameri tra cui scegliere.
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Servizio di ricerca sugli aptameri
Introduzione ad Aptamer
Gli aptameri sono molecole di acido nucleico a singolo filamento (come DNA o RNA) che vengono selezionate in vitro da una libreria di oligonucleotidi sintetici con sequenze assegnate casualmente mediante un processo chiamato screening SELEX, che prevede più cicli di selezione iterativa. I principali servizi di sviluppo di aptameri offerti da Alpha Lifetech includono la costruzione di librerie di aptameri, lo screening SELEX degli aptameri, il sequenziamento SELEX degli aptameri, l'analisi della sequenza degli aptameri e altre analisi sugli aptameri.
Il sequenziamento SELEX combina lo screening SELEX degli aptameri con il sequenziamento ad alto rendimento. Attraverso il sequenziamento SELEX degli aptameri, è possibile determinare in modo efficiente la sequenza specifica dell'aptamero legato al bersaglio, fornendo dati di base per la successiva analisi e applicazione della sequenza dell'aptamero.
Gli aptameri sono ampiamente utilizzati nella ricerca scientifica, nel trattamento delle malattie, nella costruzione di biosensori, nella scoperta di farmaci e nel monitoraggio ambientale. Tuttavia, gli aptameri oligonucleotidici selezionati in vitro si degradano facilmente in vivo e possono persino mostrare tossicità. Pertanto, dopo l'ottimizzazione degli aptameri selezionati, è necessaria un'analisi in vitro per valutare il successo del loro sviluppo. In base alle diverse esigenze di analisi dei clienti, Alpha Lifetech offre una varietà di strategie di analisi degli aptameri tra cui scegliere.
Figura 1. Schema dell'analisi dell'aptamero. Fonte di riferimento:Thevendran R, Citartan M. 2022. Test per stimare l'affinità di legame degli aptameri.
Introduzione al servizio di ricerca sugli aptameri
Analisi di stabilità dell'aptamero
Esperimento di degradazione della nucleasi
Incubando l'aptamero con diversi tipi di nucleasi (come DNasi, RNasi, ecc.) in condizioni specifiche, si osserva la degradazione dell'aptamero, in modo da valutarne la resistenza alla degradazione. Ciò è utile per determinare la stabilità e la durabilità dell'aptamero nelle applicazioni pratiche.
Metodo di marcatura fluorescente
La stabilità dell'aptamero viene valutata indirettamente etichettando i fluorofori presenti sull'aptamero e osservando le variazioni del segnale di fluorescenza prima e dopo il legame con il bersaglio. Ad esempio, quando un aptamero si lega a un bersaglio, la sua conformazione può cambiare, determinando un aumento o una diminuzione del segnale di fluorescenza.
analisi della stabilità termica
La stabilità termica dell'aptamero viene valutata misurando la variazione della sua temperatura di fusione (valore Tm) a diverse temperature. Maggiore è la temperatura di fusione dell'aptamero, migliore è la sua stabilità termica.
Analisi della stabilità dinamica
La risonanza plasmonica di superficie (SPR) e altre tecnologie sono state utilizzate per monitorare in tempo reale il processo di legame e disaccoppiamento tra l'aptamero e il bersaglio, ottenere parametri dinamici (come la costante di velocità di legame, la costante di velocità di dissociazione, ecc.), comprendere ulteriormente il meccanismo di interazione tra l'aptamero e il bersaglio e valutarne la stabilità dinamica.
Analisi della stabilità strutturale
La cristallografia a raggi X, la risonanza magnetica nucleare (NMR) e altre tecniche di biologia strutturale sono state utilizzate per analizzare la struttura tridimensionale dell'aptamero e la sua stabilità strutturale.
Analisi specifica dell'aptamero
Test di legame dell'aptamero
L'affinità viene valutata eseguendo un test di legame con l'aptamero per misurare la costante di legame tra l'aptamero e la molecola bersaglio, come ad esempio la costante di dissociazione Kd. Un valore di Kd inferiore indica una maggiore affinità. Il test di legame con l'aptamero può essere utilizzato per selezionare i candidati farmaci con elevata capacità di legame e successivamente per condurre studi di farmacodinamica e farmacocinetica.
Esperimento di screening inverso
Il saggio di screening inverso è un metodo di screening che consente di escludere rapidamente le molecole non bersaglio da un ampio numero di molecole candidate. Lo screening inverso è progettato per escludere le molecole che non possiedono la proprietà o la funzione desiderata. La chiave dello screening inverso risiede nella selezione di marcatori o condizioni di screening inverso appropriati che permettano di identificare ed eliminare le molecole non bersaglio durante il processo di screening. In questo esperimento, la selezione delle molecole non bersaglio è di fondamentale importanza. È necessario assicurarsi che le molecole non bersaglio selezionate siano rappresentative di sostanze che potrebbero interferire con lo screening degli aptameri e che i possibili fattori interferenti siano presi in considerazione nel modo più completo possibile.
Esperimento di inibizione competitiva
Aggiungendo un numero eccessivo di competitori (come molecole con struttura simile alla molecola bersaglio) al sistema di legame tra l'aptamero e la molecola bersaglio, si osserva una variazione nella capacità di legame tra l'aptamero e la molecola bersaglio. Se la capacità dell'aptamero di legarsi alla molecola bersaglio si riduce significativamente, ciò indica che l'aptamero possiede un'elevata specificità.
In alcuni casi, gli esperimenti di inibizione competitiva possono essere utilizzati come parte integrante o complementare degli esperimenti di screening inverso. Ad esempio, nel processo di screening dei farmaci, la capacità della molecola del farmaco di legarsi alla proteina bersaglio può essere valutata mediante esperimenti di inibizione competitiva, e successivamente si possono utilizzare esperimenti di screening inverso per eliminare i composti che si legano troppo fortemente alle cellule o ai tessuti normali.
Analisi della citotossicità degli aptameri
Esistono diversi metodi sperimentali per l'analisi della citotossicità degli aptameri, progettati per valutare gli effetti degli aptameri sulla sopravvivenza, la proliferazione o la funzione cellulare.
| Metodi | Introduzione dettagliata | Vantaggio | Svantaggio |
|---|---|---|---|
| Metodo di rilevamento MTT | Il test MTT è un metodo basato sull'attività enzimatica nei mitocondri delle cellule viventi. La succinato deidrogenasi presente nei mitocondri delle cellule viventi è in grado di ridurre l'MTT esogeno in formazano, un cristallo blu-violaceo insolubile in acqua, e di depositarlo all'interno della cellula, mentre le cellule morte non possiedono questa funzione. Sciogliendo questi cristalli con dimetilsolfossido (DMSO) e rilevando l'assorbanza a specifiche lunghezze d'onda (come 490 nm o 570 nm) mediante un analizzatore enzimatico, è possibile valutare indirettamente il numero di cellule viventi e quindi la citotossicità dell'aptamero. | Elevata sensibilità, economicità e praticità | Carico di lavoro elevato, i solventi organici possono causare danni alle cellule; è possibile ottenere solo i risultati sperimentali finali e non è possibile osservare il processo completo di citotossicità. |
| Metodo di rilevamento CCK-8 | Il Cell Counting Kit-8 (CCK-8) è un metodo di rilevamento colorimetrico ad alta sensibilità e non radioattivo. Il CCK-8 contiene WST-8, che viene ridotto dalla deidrogenasi nei mitocondri delle cellule viventi per produrre metilzan arancione altamente solubile in acqua. La quantità di colorante mezan prodotta è linearmente correlata al numero di cellule viventi, e il numero di cellule viventi può essere indirettamente valutato misurando il valore di assorbimento della luce del colorante mezan alla lunghezza d'onda di 450 nm, in modo da poter valutare la citotossicità dell'aptamero. | Funzionamento semplice, non è necessario lavare le cellule, rilevamento rapido, ampio intervallo di rilevamento lineare, elevata sensibilità, buona ripetibilità, bassa citotossicità | Costo elevato dei reagenti; a volte è difficile stabilire se la riduzione dell'assorbanza sia dovuta a una diminuzione del numero di cellule viventi o a una diminuzione dell'attività della deidrogenasi cellulare stessa. |
| Metodo di rilevamento LDH | La lattato deidrogenasi (LDH) è un enzima stabile nel citoplasma delle cellule che, in caso di danneggiamento della membrana cellulare, viene rilasciato all'esterno della cellula. La LDH catalizza la conversione dell'acido lattico in piruvato, il quale reagisce con i sali di tetrazolio (INT) per formare una sostanza cristallina di colore viola. Misurando l'assorbanza a una specifica lunghezza d'onda (ad esempio 490 nm), è possibile valutare il grado di danno cellulare e, di conseguenza, la citotossicità dell'aptamero. | Riflette direttamente il tasso di mortalità cellulare, provoca meno danni alle cellule e non vi è contaminazione da isotopi radioattivi. | La necessità di estrarre frequentemente le cellule dall'incubatrice rende l'operazione più complessa; è possibile ottenere solo i risultati sperimentali finali e non è possibile osservare l'intero processo di citotossicità. |
| Analisi in tempo reale delle immagini di cellule vive | Utilizzando un analizzatore di immagini cellulari in tempo reale, lo strumento è stato posizionato nell'incubatrice per osservare e registrare l'intero ciclo di crescita cellulare in tempo reale. La citotossicità degli aptameri può essere valutata analizzando i cambiamenti morfologici e le curve di crescita delle cellule. Questo metodo può fornire risultati video e quantitativi dei processi citotossici, mantenendo al contempo stabile l'ambiente di crescita cellulare. | Consente di monitorare il processo citotossico in tempo reale, tramite imaging non distruttivo, riducendo le interferenze e i danni alle cellule; sono disponibili sia risultati video che quantitativi per un'analisi approfondita. | I costi delle apparecchiature sono elevati e richiedono competenze operative professionali e capacità di analisi dei dati. |
KACHI
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