Servizio di ricerca sugli aptameri
In base alle diverse esigenze di analisi dei clienti, Alpha Lifetech dispone di diverse strategie di analisi degli aptameri tra cui i clienti possono scegliere.
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Servizio di ricerca sugli aptameri
Introduzione all'Aptamer
Gli aptameri sono molecole di acido nucleico a singolo filamento (come DNA o RNA) che vengono selezionate in vitro da una libreria di oligonucleotidi sintetici con sequenze assegnate in modo casuale tramite un processo chiamato screening SELEX, che prevede più cicli di selezione iterativa. I principali componenti dei servizi di sviluppo di aptameri di proprietà di Alpha Lifetech includono la costruzione di librerie di aptameri, lo screening SELEX degli aptameri, il sequenziamento SELEX degli aptameri, l'analisi della sequenza degli aptameri e altre analisi degli aptameri.
Il sequenziamento SELEX combina lo screening SELEX degli aptameri con il sequenziamento ad alto rendimento. Attraverso il sequenziamento SELEX degli aptameri, è possibile determinare in modo efficiente la sequenza specifica dell'aptamero legato al bersaglio, fornendo dati di base per la successiva analisi e applicazione della sequenza dell'aptamero.
Gli aptameri sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca scientifica, nel trattamento delle malattie, nella costruzione di biosensori, nella scoperta di nuovi farmaci e nel monitoraggio ambientale. Tuttavia, gli aptameri oligonucleotidici analizzati in vitro si degradavano facilmente in vivo e presentavano persino tossicità. Pertanto, dopo l'ottimizzazione degli aptameri analizzati, è necessaria un'analisi in vitro per valutare il successo dello sviluppo degli aptameri. In base alle diverse esigenze di analisi dei clienti, Alpha Lifetech offre una varietà di strategie di analisi degli aptameri tra cui scegliere.
Fig. 1 Diagramma dell'analisi dell'aptamero. Fonte di riferimento:Thevendran R, Citartan M. 2022. Saggi per stimare l'affinità di legame degli aptameri.
Introduzione al servizio di ricerca sugli aptameri
Analisi della stabilità dell'aptamero
Esperimento di degradazione della nucleasi
Incubando l'aptamero con diversi tipi di nucleasi (come DNasi, RNasi, ecc.) in condizioni specifiche, si osserva la degradazione dell'aptamero, in modo da valutarne la capacità anti-degradazione. Questo è utile per determinare la stabilità e la durabilità dell'aptamero in applicazioni pratiche.
Metodo di etichettatura fluorescente
La stabilità dell'aptamero viene valutata indirettamente marcando i fluorofori presenti sull'aptamero e osservando le variazioni del segnale di fluorescenza prima e dopo il legame con il bersaglio. Ad esempio, quando un aptamero si lega a un bersaglio, la sua conformazione può cambiare, determinando un aumento o una diminuzione del segnale di fluorescenza.
Analisi della stabilità termica
La stabilità termica dell'aptamero viene valutata misurando la variazione della sua temperatura di fusione (valore Tm) a diverse temperature. Maggiore è la temperatura di fusione dell'aptamero, migliore è la sua stabilità termica.
Analisi di stabilità dinamica
La risonanza plasmonica di superficie (SPR) e altre tecnologie sono state utilizzate per monitorare in tempo reale il processo di legame e disaccoppiamento tra l'aptamero e il bersaglio, ottenere parametri dinamici (come la costante di velocità di legame, la costante di velocità di dissociazione, ecc.), comprendere meglio il meccanismo di interazione tra l'aptamero e il bersaglio e valutarne la stabilità dinamica.
Analisi di stabilità strutturale
Per analizzare la struttura tridimensionale dell'aptamero e la sua stabilità strutturale sono state utilizzate la cristallografia a raggi X, la risonanza magnetica nucleare (NMR) e altre tecniche di biologia strutturale.
Analisi specifica dell'aptamero
Test di legame dell'aptamero
L'affinità viene valutata eseguendo un test di legame dell'aptamero per misurare la costante di legame tra l'aptamero e la molecola bersaglio, come la costante di dissociazione Kd. Un valore di Kd inferiore indica un'affinità maggiore. Il test di legame dell'aptamero può selezionare i farmaci candidati con un'elevata capacità di legame e quindi condurre successivi studi di farmacodinamica e farmacocinetica.
Esperimento di screening inverso
Il test di reverse screening è un metodo di screening per escludere rapidamente molecole non bersaglio da un gran numero di molecole candidate. Il reverse screening è progettato per escludere molecole che non possiedono questa proprietà o funzione. La chiave per il reverse screening è selezionare marcatori o condizioni di reverse screening appropriati che consentano di identificare e rimuovere le molecole non bersaglio durante il processo di screening. In questo esperimento, la selezione delle molecole non bersaglio è molto importante. È necessario assicurarsi che le molecole non bersaglio selezionate siano rappresentative di sostanze che potrebbero interferire con lo screening degli aptameri e che i possibili fattori interferenti siano considerati il più possibile.
Esperimento di inibizione competitiva
Aggiungendo un numero eccessivo di competitori (come molecole con struttura simile alla molecola bersaglio) al sistema di legame dell'aptamero e della molecola bersaglio, si osserva una variazione della capacità di legame dell'aptamero e della molecola bersaglio. Se la capacità dell'aptamero di legare la molecola bersaglio è significativamente ridotta, ciò indica che l'aptamero ha un'elevata specificità.
In alcuni casi, gli esperimenti di inibizione competitiva possono essere utilizzati come parte integrante o complementare degli esperimenti di reverse screening. Ad esempio, nel processo di screening di farmaci, la capacità della molecola di legarsi alla proteina bersaglio può essere valutata mediante esperimenti di inibizione competitiva, per poi utilizzare esperimenti di reverse screening per rimuovere i composti che si legano troppo fortemente a cellule o tessuti normali.
Analisi della citotossicità dell'aptamero
Esistono diversi metodi sperimentali per l'analisi della citotossicità degli aptameri, concepiti per valutare gli effetti degli aptameri sulla sopravvivenza, la proliferazione o la funzione cellulare.
| Metodi | Introduzione dettagliata | Vantaggio | Svantaggio |
|---|---|---|---|
| Metodo di rilevamento MTT | Il test dell'MTT è un metodo basato sull'attività enzimatica nei mitocondri delle cellule viventi. La succinato deidrogenasi presente nei mitocondri delle cellule viventi può ridurre l'MTT esogeno a cristalli blu-viola insolubili in acqua, il Formazano, e depositarlo nella cellula, mentre le cellule morte non svolgono tale funzione. La dissoluzione di questi cristalli mediante dimetilsolfossido (DMSO) e la rilevazione dell'assorbanza a specifiche lunghezze d'onda (come 490 nm o 570 nm) su un enzimametro possono riflettere indirettamente il numero di cellule viventi e quindi valutare la citotossicità dell'aptamero. | Alta sensibilità, economicità e praticità | Carico di lavoro elevato, solventi organici possono causare danni alle cellule; si possono ottenere solo i risultati sperimentali finali e non è possibile visualizzare il processo completo di citotossicità |
| Metodo di rilevamento CCK-8 | Il Cell Counting Kit-8 (CCK-8) è un metodo di rilevamento colorimetrico ad alta sensibilità e non radioattivo. Il CCK-8 contiene WST-8, che viene ridotto dalla deidrogenasi nei mitocondri delle cellule viventi per produrre combustibile metilzan arancione altamente idrosolubile. La quantità di colorante mezan prodotta è linearmente correlata al numero di cellule viventi, e il numero di cellule viventi può essere riflesso indirettamente misurando il valore di assorbimento della luce del colorante mezan alla lunghezza d'onda di 450 nm, in modo da valutare la citotossicità dell'aptamero. | Funzionamento semplice, nessuna necessità di lavare le cellule, rilevamento rapido, ampio intervallo di rilevamento lineare, elevata sensibilità, buona ripetibilità, poca citotossicità | Elevato prezzo del reagente; a volte è difficile dire se la ridotta assorbanza sia dovuta a una diminuzione del numero di cellule viventi o a una diminuzione dell'attività della deidrogenasi cellulare stessa |
| Metodo di rilevamento LDH | L'LDH (lattato deidrogenasi) è un enzima stabile nel citoplasma cellulare e, quando la membrana cellulare è danneggiata, viene rilasciato all'esterno della cellula. L'LDH può catalizzare la formazione di acido lattico con piruvato e reagire con l'INT (sali di tetrazolio) per formare una sostanza cristallina viola. Misurandone l'assorbanza a una lunghezza d'onda specifica (ad esempio 490 nm), è possibile valutare il grado di danno cellulare e quindi la citotossicità dell'aptamero. | Riflette direttamente il tasso di mortalità delle cellule, provoca meno danni alle cellule e non c'è contaminazione da isotopi radioattivi | La necessità di estrarre frequentemente le cellule dall'incubatrice rende l'operazione più complicata; si possono ottenere solo i risultati sperimentali finali e non è possibile visualizzare il processo completo di citotossicità. |
| Analisi di immagini di cellule vive in tempo reale | Utilizzando un analizzatore di immagini di cellule vive in tempo reale, lo strumento è stato posizionato nell'incubatrice per osservare e registrare l'intero processo di crescita cellulare in tempo reale. La citotossicità degli aptameri può essere valutata analizzando i cambiamenti morfologici e le curve di crescita delle cellule. Questo metodo può fornire risultati video e quantificati dei processi citotossici, mantenendo stabile l'ambiente di crescita cellulare. | Può monitorare il processo citotossico in tempo reale, con immagini non distruttive, riducendo le interferenze e i danni alle cellule; sono disponibili risultati sia video che quantificati per analisi approfondite. | I costi delle attrezzature sono elevati e richiedono competenze operative professionali e capacità di analisi dei dati |
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16/07/2018 
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