Nel 1960 fu proposto il concetto di anticorpi bispecifici. Gli anticorpi bispecifici, noti anche come anticorpi monoclonali bispecifici, sono anticorpi sintetizzati artificialmente mediante ingegneria genetica. In quanto anticorpi artificiali ingegnerizzati, gli anticorpi bispecifici appartengono generalmente alla sottoclasse IgG e contengono un frammento di legame all'antigene che si lega alla subunità CD3. Gli anticorpi bispecifici possiedono due siti di legame all'antigene specifici, in grado di legare e riconoscere simultaneamente due antigeni diversi, o due epitopi diversi di un antigene. Rispetto agli anticorpi monoclonali, gli anticorpi bispecifici presentano un ulteriore sito di legame all'antigene specifico, possedendo quindi una maggiore specificità e capacità di targeting, che consente di colpire con maggiore precisione le cellule tumorali e ridurre la tossicità fuori bersaglio. Gli anticorpi bispecifici possono svolgere simultaneamente molteplici funzioni biologiche, come il reclutamento di cellule immunitarie, il blocco delle vie di segnalazione e l'uccisione diretta delle cellule tumorali. I primi anticorpi bispecifici venivano preparati principalmente tramite coniugazione chimica o fusione cellulare, ma questo metodo potrebbe aver avuto una progressione lenta a causa della combinazione casuale e della difficoltà nell'isolare la combinazione target. Con il continuo sviluppo delle tecnologie di ingegneria genetica, sono state sviluppate numerose nuove piattaforme tecnologiche, come Knots in Holes (KIH), CrossMab, DVD Ig, ecc. Queste piattaforme risolvono efficacemente problemi quali le discrepanze tra catena pesante e catena leggera, migliorando l'uniformità e la resa degli anticorpi bispecifici.

I principali metodi per la produzione di anticorpi bispecifici includono l'accoppiamento chimico, l'ibridoma a quattro fonti e la preparazione di anticorpi tramite ingegneria genetica. Tra questi, il metodo di accoppiamento chimico unisce due IgG intatte o due frammenti anticorpali F(ab')2 in anticorpi bispecifici utilizzando agenti di accoppiamento chimico come la ftalimmide e l'acido ditioacilbenzoico. Questo metodo è semplice e facile da eseguire, ma può danneggiare il sito di legame dell'antigene, ridurre l'attività anticorpale e l'agente di accoppiamento stesso presenta un certo grado di cancerogenicità. Il metodo dell'ibridoma a quattro fonti si basa sulla fusione di cellule somatiche provenienti da due diverse linee cellulari di ibridoma per esprimere le corrispondenti IgG di topo. Attraverso la tecnologia dell'ingegneria genetica, gli anticorpi possono essere modificati geneticamente per formare anticorpi bispecifici. Vengono costruiti due diversi anticorpi monoclonali e i frammenti Fab o le regioni variabili della catena pesante e della catena leggera dei due anticorpi vengono scissi separatamente. Attraverso una reazione di cross-linking o una tecnologia di ricombinazione di catena, i due frammenti vengono combinati per formare un anticorpo bispecifico. Sebbene la complessità della tecnologia di ingegneria genetica sia relativamente elevata, attualmente rappresenta il metodo più comunemente utilizzato per la produzione di anticorpi bispecifici al fine di regolarne la struttura e la funzione. Nella progettazione di anticorpi bispecifici, si può sfruttare il principio della reattività crociata tra anticorpi, ma tale reattività può causare reazioni non specifiche; pertanto, è necessario prestare particolare attenzione nell'applicazione pratica della progettazione di anticorpi bispecifici, ad esempio nella terapia con anticorpi bispecifici.

La purificazione degli anticorpi bispecifici è il processo di isolamento e purificazione di anticorpi target ad elevata purezza. Per rimuovere alcune impurità solubili si utilizzano due metodi: la centrifugazione e la filtrazione profonda. L'anticorpo bispecifico target viene inizialmente catturato mediante cromatografia di affinità. Per gli anticorpi bispecifici di tipo IgG si utilizza la cromatografia di affinità con proteina A, mentre per gli anticorpi bispecifici non di tipo IgG si può utilizzare la cromatografia di affinità basata sulla catena leggera. Successivamente, l'anticorpo viene incubato in condizioni di pH basso per un certo periodo di tempo, causando la disgregazione della struttura proteica sulla superficie dell'involucro virale, con conseguente perdita della capacità di infettare le cellule. Una filtrazione profonda intermedia viene eseguita per rimuovere ulteriormente le impurità, come le proteine ​​della cellula ospite (HCP). La purezza degli anticorpi viene migliorata mediante metodi come la cromatografia a scambio ionico, e gli eventuali virus residui vengono rimossi tramite tecniche di nanofiltrazione o ultrafiltrazione. Infine, il campione viene concentrato e sostituito con un tampone di formulazione appropriato.