Nel 1960 fu proposto il concetto di anticorpi bispecifici. Gli anticorpi bispecifici, noti anche come anticorpi monoclonali bispecifici, sono anticorpi sintetizzati artificialmente utilizzando tecnologie di ingegneria genetica. In quanto anticorpi artificiali ingegnerizzati, gli anticorpi bispecifici appartengono solitamente alla sottoclasse IgG e contengono un frammento di legame antigenico che ha come bersaglio la subunità CD3. Gli anticorpi bispecifici hanno due siti di legame antigenici specifici che possono legare e riconoscere simultaneamente due antigeni diversi, o due diversi epitopi di un antigene. Rispetto agli anticorpi monoclonali, gli anticorpi bispecifici hanno un sito di legame antigenico specifico aggiuntivo, possedendo quindi una maggiore specificità e capacità di targeting, che può colpire più accuratamente le cellule tumorali e ridurre la tossicità off-target. Gli anticorpi bispecifici possono svolgere simultaneamente molteplici funzioni biologiche, come il reclutamento di cellule immunitarie, il blocco delle vie di segnalazione e l'uccisione diretta delle cellule tumorali. I primi anticorpi bispecifici venivano preparati principalmente mediante coniugazione chimica o fusione cellulare, ma questo metodo potrebbe aver progredito lentamente a causa della combinazione casuale e della difficoltà di isolare la combinazione bersaglio. Con il continuo sviluppo della tecnologia di ingegneria genetica, sono state sviluppate molte nuove piattaforme tecnologiche, come i nodi nei buchi (KIH), CrossMab, DVD Ig, ecc. Queste piattaforme risolvono efficacemente problemi come le discrepanze tra catene pesanti e catene leggere e migliorano l'uniformità e la resa degli anticorpi bispecifici.

I principali metodi per la produzione di anticorpi bispecifici includono l'accoppiamento chimico, l'ibridoma a quattro sorgenti e la preparazione di anticorpi mediante ingegneria genetica. Tra questi, il metodo dell'accoppiamento chimico accoppia due IgG intatte o due frammenti di anticorpi F(ab')2 in anticorpi bispecifici utilizzando agenti di accoppiamento chimico come la ftalimmide e l'acido ditioacilbenzoico. Questo metodo è semplice e facile da usare, ma può danneggiare il sito di legame dell'antigene, ridurre l'attività dell'anticorpo e l'agente di accoppiamento stesso presenta anche un certo grado di cancerogenicità. Il metodo dell'ibridoma a quattro sorgenti si basa sulla fusione di cellule somatiche provenienti da due diverse linee cellulari di ibridoma per esprimere le corrispondenti IgG murine. Attraverso la tecnologia dell'ingegneria genetica, gli anticorpi possono essere geneticamente modificati per formare anticorpi bispecifici. Sono stati costruiti due diversi anticorpi monoclonali e i frammenti Fab o le regioni variabili della catena pesante e della catena leggera dei due anticorpi sono stati scissi separatamente. Attraverso la reazione di cross-linking o la tecnologia di ricombinazione di catena, i due frammenti sono stati combinati per formare un anticorpo bispecifico. Sebbene la complessità della tecnologia di ingegneria genetica sia relativamente elevata, questa è attualmente il metodo più comunemente utilizzato per la produzione di anticorpi bispecifici, al fine di modificarne la struttura e la funzione. Nella progettazione di anticorpi bispecifici, è possibile utilizzare il principio della reattività crociata degli anticorpi, ma la reattività crociata degli anticorpi può causare reazioni aspecifiche, pertanto sarà attentamente valutato nell'applicazione pratica della progettazione di anticorpi bispecifici, come la terapia con anticorpi bispecifici.

La purificazione degli anticorpi bispecifici è il processo di isolamento e purificazione di anticorpi target ad elevata purezza. Per rimuovere alcune impurità solubili, vengono utilizzati due metodi: centrifugazione e filtrazione profonda. L'anticorpo bispecifico target viene inizialmente catturato mediante cromatografia di affinità. Per gli anticorpi bispecifici di tipo IgG, viene utilizzata la cromatografia di affinità per la proteina A, mentre per gli anticorpi bispecifici di tipo non IgG, può essere utilizzata la cromatografia di affinità basata sulla catena leggera. Successivamente, l'anticorpo viene incubato a basso pH per un certo periodo di tempo, causando la rottura della struttura proteica sulla superficie dell'involucro virale, perdendo così la capacità di infettare le cellule. Una filtrazione profonda intermedia viene eseguita per rimuovere ulteriormente le impurità, come le proteine ​​della cellula ospite (HCP). La purezza degli anticorpi viene migliorata mediante metodi come la cromatografia a scambio ionico, e eventuali virus residui vengono rimossi mediante tecniche di nanofiltrazione o ultrafiltrazione. Infine, il campione viene concentrato e sostituito con un tampone di formulazione idoneo.