Servizio di sviluppo di anticorpi monoclonali
Alpha Lifetech è in grado di fornire servizi di predizione degli epitopi, sintesi di peptidi, espressione proteica, produzione di anticorpi policlonali o monoclonali, nonché purificazione di anticorpi da colture cellulari, liquido ascitico o siero intero.
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Alpha Lifetech Inc.Può fornire predizione di epitopi, sintesi di peptidi, espressione proteica, produzione di anticorpi policlonali o monoclonali, nonché purificazione di anticorpi da colture cellulari, liquido ascitico o siero intero.
Alpha Lifetech Inc.Vantiamo una consolidata esperienza nella fornitura di diversi servizi di linee cellulari stabili, tra cui cellule ibridoma, linee cellulari con editing genomico, linee cellulari con silenziamento genico e linee cellulari con sovraespressione. Ci impegniamo a offrire servizi di linee cellulari personalizzate e all'avanguardia a ogni cliente, servizi comprovati e affidabili.
Strategia di sviluppo degli anticorpi
1. Progettazione e preparazione dell'antigene
Questi antigeni possono essere proteine, peptidi o altre molecole. La progettazione di immunogeni richiede un approccio completo che integri la conoscenza della struttura dell'antigene, dell'immunologia e dei sistemi di somministrazione. Alpha Lifetech dispone di una tecnologia di progettazione di antigeni in grado di creare immunogeni su misura per i clienti che ne hanno bisogno.
Alpha Lifetech offre ai propri clienti una vasta gamma di prodotti a base di proteine ricombinanti. Disponiamo di diversi sistemi di espressione proteica, come il sistema di espressione in E. coli, il sistema di espressione in lievito, il sistema di espressione in baculovirus-insetto, il sistema di espressione in cellule di mammifero, ecc., per produrre le proteine ricombinanti necessarie alla vostra ricerca.
2. Immunizzazione degli animali
Alpha Lifetech può fornire immunogeni ai clienti e mette a disposizione animali immunizzati come topi, conigli, pecore, alpaca, porcellini d'India, criceti, ecc., tra cui scegliere.
3. Metodi di produzione di anticorpi monoclonali
●Produzione di Mabs tramite tecnologia Hybridoma
L'ibridoma è una cellula ibrida prodotta dalla fusione di due tipi di cellule, ovvero una linea cellulare di mieloma murino e plasmacellule (linfociti B), in cui la cellula eterozigote è in grado di produrre anticorpi continui contro l'antigene di interesse in vitro. La produzione di una linea cellulare di ibridoma si articola in tre fasi: progettazione dell'antigene (apteni, piccole molecole e peptidi), immunizzazione animale, fusione cellulare e screening dei cloni positivi. Grazie a metodologie di immunizzazione uniche, otteniamo efficienze di fusione cellulare eccezionalmente elevate (da 1 a 10 ibridomi per mille cellule B) e alti titoli anticorpali, massimizzando il nostro tasso di successo nei successivi test analitici che includono screening biochimici, saggi cellulari in vitro e studi su animali.
●Produzione di anticorpi monoclonali (MAB) tramite tecnologia di visualizzazione fagica.
La tecnica del phage display offre un altro metodo per generare anticorpi monoclonali. I linfociti B vengono isolati dal sangue animale e il loro mRNA viene estratto. Tramite PCR, questo mRNA viene convertito in cDNA, che amplifica tutti i segmenti VH e VL. Questi segmenti vengono quindi clonati in un vettore, tipicamente come frammenti variabili a catena singola (scFv), insieme alla proteina PIII di un batteriofago. Successivamente, questo costrutto viene utilizzato per infettare E. coli, con conseguente creazione di una libreria contenente circa 10^10 cellule tramite inoculazione con un fago helper. E. coli è quindi in grado di secernere il batteriofago contenente i segmenti VH e VL come parte del suo rivestimento. In seguito, è possibile selezionare specifici segmenti VH e VL che prendono di mira l'antigene di interesse e utilizzarli per re-inoculare E. coli con il batteriofago. Le cellule contenenti il plasmide vengono quindi isolate e sequenziate.
4. Screening di fusione
●Fusione e selezione cellulare
Le cellule B prelevate vengono quindi fuse con cellule di mieloma, che sono cellule cancerose in grado di proliferare indefinitamente in coltura. La fusione viene in genere realizzata utilizzando una tecnica come la fusione con polietilenglicole (PEG).
Dopo la fusione, le cellule ibridoma vengono coltivate in un terreno di coltura selettivo che permette la sopravvivenza solo delle cellule ibridoma. Il terreno di coltura contiene solitamente aminopterina, che impedisce la crescita delle cellule mieloma non fuse.
●Screening e Cloning
Le cellule ibridoma risultanti vengono analizzate per verificare la produzione di anticorpi specifici per l'antigene bersaglio. Questo viene in genere fatto utilizzando tecniche come il test immunoenzimatico (ELISA), il Western blot, l'immunoprecipitazione e la citometria a flusso.
Una volta identificate le cellule ibridoma che producono l'anticorpo, queste vengono clonate per generare una popolazione di cellule identiche. Ciò garantisce che l'anticorpo prodotto da ciascuna cellula ibridoma sia identico.
5. Verifica funzionale dell'anticorpo
Alpha Lifetech offre servizi di validazione funzionale degli anticorpi, come Western blotting, immunoistochimica o saggi funzionali, per caratterizzare gli anticorpi monoclonali e confermarne la specificità, l'affinità e la funzionalità.
6. Ottimizzazione degli anticorpi
La purificazione degli anticorpi dal supernatante di coltura avviene tramite tecniche quali la cromatografia di affinità con proteina A o proteina G. Alpha Lifetech offre anche metodi di modificazione degli anticorpi per migliorarne l'affinità.
7. Produzione di anticorpi
Alpha Lifetech è in grado di valutare anticorpi candidati per applicazioni di screening ad alta produttività e per la produzione su larga scala.
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Come scegliere l'ibridoma di fusione più adatto?
Durante il processo di fusione, 10-15 piastre per microtitolazione a 96 pozzetti vengono seminate con la miscela ibrida di fusione. Ogni piastra viene alimentata con il terreno di selezione HAT-IMDM e mantenuta in un incubatore ad anidride carbonica a 37 gradi Celsius. 9-14 giorni dopo la fusione, i surnatanti ibridi vengono analizzati per la presenza dell'anticorpo specifico di interesse.
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Come migliorare l'efficienza del processo di selezione?
La fusione delle plasmacellule con le loro controparti mielomatose non è efficace al 100%. Anche in condizioni ottimali e con la stimolazione più efficace, la fusione cellulare produce comunque una miscela di cellule non confluenti e confluenti che devono essere separate. Per migliorare l'efficienza del processo di selezione, le cellule mielomatose utilizzate per la fusione sono prive di HGPRT, un enzima chiave nella via di recupero dei nucleotidi. La miscela è stata quindi coltivata in un terreno HAT, dove solo le cellule con l'enzima HGPRT, ovvero gli ibridomi che hanno ereditato l'HGPRT dalle plasmacellule, risultavano vitali.
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Come si effettua lo screening delle linee cellulari di ibridoma per l'attività anticorpale?
La valutazione delle varietà ibride è una fase cruciale. Solitamente, lo screening del surnatante di ibridomi, cloni e subcloni viene effettuato mediante test immunoenzimatico (ELISA), Western blot e citometria a flusso (FACS). Noi abbiamo scelto di condurre tutto lo screening del surnatante nel nostro laboratorio.
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Fornire istruzioni dettagliate su come condurre lo screening dell'attività anticorpale?
I supernatanti di ibridoma da analizzare possono variare da 500 a 1.440 campioni e saranno pronti per l'analisi entro 9-14 giorni. La preparazione potrebbe richiedere da tre a cinque giorni oppure i campioni potrebbero essere tutti pronti lo stesso giorno, pertanto è importante che il laboratorio del cliente si prepari con settimane di anticipo, disponendo di test di screening secondari specifici e funzionanti.
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Perché gli ibridomi positivi devono essere subclonati?
Dopo l'identificazione dei pozzetti positivi durante la procedura iniziale di screening ELISA, gli ibridomi sono stati trasferiti in un volume maggiore, ovvero in piastre a 24 pozzetti, in preparazione alla procedura di subclonazione. La subclonazione degli ibridomi viene solitamente eseguita mediante un metodo di diluizione limitante per garantire l'isolamento di monocloni stabili. La tecnica prevede la diluizione delle colture di ibridomi e la loro dispersione in piastre a 96 pozzetti per ottenere la monoclonalità (una cellula per pozzetto). È necessario eseguire almeno due diluizioni limitanti per ridurre il rischio di sviluppare popolazioni miste di ibridomi.
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Quali sono i vantaggi dell'utilizzo della tecnologia degli ibridomi per la scoperta di anticorpi?
Le linee cellulari ibride sono state elogiate per la loro capacità di produrre anticorpi con elevata affinità, stabilità e specificità nel modo più economicamente vantaggioso.
Servizio di produzione di anticorpi monoclonali murini
Alpha Lifetech è in grado di fornire un servizio completo di ibridomi murini a scienziati di tutto il mondo. Questi servizi includono la progettazione/sintesi di antigeni, l'immunizzazione dei topi, la fusione cellulare e la selezione/caratterizzazione degli ibridomi, ambiti in cui possiamo specializzarci per ogni singolo progetto.
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Servizio di produzione di anticorpi monoclonali di coniglio
Alpha Lifetech vanta una lunga esperienza nel campo degli anticorpi e ha sviluppato una piattaforma completa per lo sviluppo di anticorpi monoclonali di coniglio.
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16/07/2018 
