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Notizie | Il clustering delle regioni che determinano la complementarietà può causare la disfunzione delle cellule CAR-T
2025-01-09
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In uno studio pubblicato il 13 agosto 2023 su Nature Communications, un team di ricercatori ha identificato che il ciclo della regione determinante la complementarietà (CDR) in un frammento variabile a catena singola (scFv) può portare all'aggregazione CAR, che può causare l'insufficienza del recettore antigenico chimerico (CAR) - cellule T, morte cellulare e riduzione della reattività delle cellule tumorali all'espressione dell'antigene bersaglio, con conseguente attivazione indipendente dall'antigene e potenziale compromissione funzionale.
Contesto e metodologiaSFONDO
La terapia cellulare CAR-T è altamente efficace per il trattamento dei tumori del sangue e, in questa terapia cellulare, la progettazione dei CAR è ancora più importante. In questo studio, il dominio extracellulare del recettore umano dell'interleuchina-13 alfa 2 (IL13R alfa 2) è stato co-espresso con la biotina ligasi BirA utilizzando il sistema di espressione multiBac. Dopo una serie di ottimizzazioni dell'espressione della proteina recettoriale, sono state eseguite la purificazione e la validazione della proteina. Una libreria sintetica di scFv umano è stata utilizzata per lo screening mediante phage display e i corrispondenti anticorpi scFv sono stati selezionati per la produzione mediante screening in fase solida e analisi del saggio di legame. Anticorpi idonei sono stati selezionati per la costruzione e il confezionamento del vettore lentivirale mediante saggi SPR ed ELISA. I ricercatori hanno inoltre trasdotto e coltivato cellule T, e hanno quindi esaminato i CAR in queste cellule mediante microscopia confocale. La distribuzione è in alto. Per analizzare il comportamento delle cellule CAR-T, i ricercatori hanno valutato il legame delle cellule CAR-T al recettore IL13R α 2 ricombinante, hanno colorato i marcatori di superficie delle cellule T e hanno studiato l'espressione del CAR sulla superficie e all'interno delle cellule. Inoltre, hanno esplorato la proliferazione delle cellule CAR-T e la secrezione di citochine, analizzando l'espressione genica in diversi costrutti CAR-T, evidenziandone le differenze. Gli esperimenti in vivo prevedono l'impianto di cellule tumorali in situ nei topi, seguito dalla terapia con CAR-T e dal monitoraggio della crescita tumorale tramite sistemi di imaging in vivo (IVIS). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando GraphPad Prism e marcatori di significatività standard.
ConclusioneCONCLUSIONE
Nello studio attuale, i ricercatori hanno valutato la struttura del costrutto CAR, il suo scFv extracellulare, il linker e altri domini per comprenderne l'impatto sulle prestazioni delle cellule CAR-T. È stato determinato che il loop CDR all'interno di scFv è responsabile del riconoscimento dell'antigene e che alcune strutture all'interno di scFv possono attivare inavvertitamente la segnalazione del CAR, compromettendo potenzialmente la funzione delle cellule T. Le interazioni all'interno del loop CDR possono ulteriormente influenzare la stabilità del CAR. Piccole differenze nel loop CDR possono alterare notevolmente l'efficacia delle cellule CAR-T ed è stato proposto un nuovo metodo di screening rapido per il comportamento del CAR.
Introduzione dettagliata del contenuto
Introduzione al CAR-T
La chiave della terapia con cellule CAR-T (terapia con cellule T con recettori antigenici chimerici) è contribuire a coordinare la risposta immunitaria delle cellule T, modificarle, inserire geni CAR ed esprimerli sulla superficie delle cellule T come proteine CAR con recettori antigenici chimerici. Le cellule CAR possono riconoscere direttamente gli antigeni sulla superficie delle cellule tumorali, realizzando così un metodo terapeutico specifico per identificare e distruggere le cellule tumorali nell'organismo del paziente. Dal 2017, la FDA ha approvato sei terapie con cellule CAR-T per il trattamento di tumori del sangue come il linfoma. Tuttavia, sussistono ancora difficoltà nel trattamento dei tumori solidi, poiché i mediatori circostanti possono impedire alle cellule CAR di riconoscere gli antigeni sulla superficie tumorale. Inoltre, i tumori solidi presentano eterogeneità, rendendo difficile ottenere effetti terapeutici a causa delle differenze nello stesso tipo di cancro all'interno dell'organismo.
Fig. 1: Terapie CAR-T approvate dalla FDA. Fonte della figura:Cellula CAR-T.
Introduzione aanticorpo scFv
scFv è un piccolo frammento di anticorpo costituito da una catena pesante (VH) e una catena leggera (VL) connesse da un breve peptide flessibile, con una dimensione di circa 25 kDa, ed è il tipo di anticorpo ricombinante più comunemente utilizzato. scFv è di piccole dimensioni, specifico, può essere prodotto su larga scala in un sistema di espressione procariotico e ha un sito di legame all'antigene intatto, il che è ampiamente utilizzato nella diagnosi e nel trattamento delle malattie.
Fig 2: anticorpo scFv
Introduzione al CDR
Le regioni determinanti la complementarietà (CDR) sono frammenti peptidici delle regioni variabili degli anticorpi che possono legarsi agli antigeni attraverso le CDR, note anche come siti di legame per l'antigene. Una molecola di anticorpo contiene due recettori per l'antigene e un recettore per l'antigene contiene sei CDR. Le CDR riflettono l'attività di legame degli antigeni agli anticorpi.
La tecnologia coinvolta
Sistema di espressione degli insetti
Il sistema di espressione cellulare di insetto a base di baculovirus è diventato uno dei sistemi più utilizzati per la produzione di routine di proteine ricombinanti. Il sistema di espressione cellulare di insetto a base di baculovirus ha espresso con successo recettori accoppiati a proteine G (GPCR), prodotto VLP (proteine a lunga durata d'azione) e prodotto vettori per virus infettivi associati alle gonadi (AAV) di tipo 2. Un esempio importante dell'applicazione di questa tecnologia è lo sviluppo di vaccini basati sulle VLP dell'HPV. Studi clinici hanno dimostrato che le VLP composte da proteine strutturali L1 di HPV 16/18, prodotte in cellule di insetto infettate da virus bastoncellari, possono prevenire efficacemente le infezioni cervicali da HPV-16 e HPV-18, nonché le anomalie e le lesioni cellulari correlate.
Figura 3: Processo di produzione. Fonte della figura:Baculovirus come vettori versatili per l'espressione proteica nelle cellule di insetti e mammiferi.
Tecnologia di visualizzazione dei fagi
La tecnologia "phage display" è nata nel 1985, quando George Smith ha segnalato la possibilità di visualizzare peptidi estranei sulla superficie di batteriofagi filamentosi. Inserendo DNA estraneo nel genoma dei fagi, le proteine di fusione vengono visualizzate sulla loro superficie. Questo metodo si è rivelato efficace per la produzione di grandi quantità di peptidi, proteine e anticorpi, consentendo la costruzione di librerie contenenti fino a 10^10 varianti diverse e può essere utilizzato per lo screening di affinità di librerie peptidiche per studiare le interazioni proteina-ligando, i siti di legame di antigeni e anticorpi e la produzione di anticorpi scFv, anticorpi Fab e nanobody.
Fig 4: Tecnologia del display fagico
Libreria sintetizzata di anticorpi scFv umani
La libreria di anticorpi sintetici, nota anche come libreria de novo, è un metodo di sintesi che utilizza tecniche come la sintesi del DNA o il phage display per progettare e sintetizzare regioni variabili complete degli anticorpi, incluse le regioni framework e le CDR, senza fare affidamento sulle librerie di anticorpi naturali. Sintetizzare DNA sintetico che codifica sequenze di anticorpi, incluse le regioni framework e le CDR, attraverso metodi chimici o enzimatici. I frammenti di DNA sintetizzati vengono assemblati in vettori di espressione anticorpale utilizzando tecniche come la PCR e quindi introdotti in sistemi di espressione come batteri, lieviti o cellule di mammifero per la produzione di anticorpi. Metodi di screening ad alta produttività possono essere utilizzati per lo screening di anticorpi con le caratteristiche desiderate nelle librerie di anticorpi, incluse le tecnologie di phage display, yeast display o ribosome display. La libreria di anticorpi sintetici presenta i seguenti vantaggi: (1) la casualità della libreria aumenta e la capacità della libreria è ampia; (2) alcuni anticorpi difficili possono essere sottoposti a screening senza immunizzare gli animali; (3) rispetto alle librerie di anticorpi naive, la progettazione delle librerie di anticorpi sintetici è diversificata.
Misurazione dell'affinità SPR
La Risonanza Plasmonica di Superficie (SPR) può essere utilizzata per analizzare l'affinità di legame e i parametri cinetici tra ligandi e analiti. La misurazione della SPR si basa sulle variazioni dell'indice di rifrazione in prossimità della superficie del sensore, dove l'analita fluisce in modo continuo e viene misurato lungo la superficie del sensore. La SPR viene utilizzata per determinare l'affinità relativa delle interazioni proteina-proteina, come l'affinità degli anticorpi verso gli antigeni bersaglio. La SPR può essere applicata per rilevare l'adsorbimento molecolare, i saggi immunoenzimatici SPR, la caratterizzazione dei materiali, l'analisi dei dati e i biosensori.
Fig. 5: Risonanza plasmonica di superficie (SPR). Fonte della figura:Sabban, Sari (2011) Sviluppo di un sistema modello in vitro per studiare l'interazione di Equus caballus IgE con il suo recettore FcεRI ad alta affinità (tesi di dottorato), Università di Sheffield, CC BY-SA 3.0
Costruzione e produzione lentivirale
I vettori lentivirali presentano un'elevata capacità di impacchettamento, un'ampia diffusione, una versatilità e una stabilità uniche, che li rendono un sistema ideale per la somministrazione genica. Il lentivirale è un tipo di virus che può causare malattie come l'AIDS. L'infezione avviene inserendo DNA nel genoma della cellula ospite. Il vettore lentivirale è un retrovirus con genoma a RNA a singolo filamento e trascrittasi inversa, in grado di inserire e modificare i geni nell'organismo.
Figura 6: struttura dell'HIV, un lentivirus. Fonte della figura:Wikipedia
RiferimentoRIFERIMENTO
[1] Sarén, T., Saronio, G., Marti Torrell, P. et al. Complementarity-determining region clustering may cause CAR-T cell dysfunction. Nat Commun 14, 4732 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40303-z
[2] Kost, T., Condreay, J. & Jarvis, D. Baculovirus come vettori versatili per l'espressione proteica in cellule di insetti e mammiferi. Nat Biotechnol 23, 567–575 (2005). https://doi.org/10.1038/nbt1095.
[3] Sparks RP, Jenkins JL, Fratti R. Uso della risonanza plasmonica di superficie (SPR) per determinare affinità di legame e parametri cinetici tra componenti importanti nei macchinari di fusione. Metodi Mol Biol. 2019;1860:199-210. doi: 10.1007/978-1-4939-8760-3_12. PMID: 30317506; PMCID: PMC8489108.
[4] https://en.wikipedia.org/wiki/Lentivirus.
[5] https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/research/car-t-cells.