Il batteriofago M13 appartiene a un gruppo di fagi filamentosi chiamati collettivamente fagi Ff. Ha una lunghezza di 900 nm e una larghezza di 6,5 nm. Contiene un genoma di DNA a singolo filamento (ssDNA) lungo 6407 bp, composto da nove geni che codificano 11 proteine ​​diverse. Tra queste, cinque proteine ​​sono proteine ​​di rivestimento, mentre sei proteine ​​sono coinvolte nella replicazione e nell'assemblaggio del fago. La più alta concentrazione di proteine ​​di rivestimento è la proteina capsidica G8P, composta da circa 2.700 unità proteiche e che forma un involucro attorno al cromosoma.

Fig. 2 Rappresentazione schematica del batteriofago M13.(Riferimento:Nozioni di base sulla tecnologia di visualizzazione dei fagi degli anticorpi)

Dal 1990, diversi formati di anticorpi sono stati utilizzati per costruire librerie fagiche, tra cui VH, VHH, scFv, diabody e anticorpi Fab. Gli scFv composti dai domini strutturali VH e VL sono anticorpi a catena singola utilizzati per costruire librerie di anticorpi scFv. Gli scFv sono caratterizzati da una breve emivita e da una bassa immunogenicità. La libreria di anticorpi Fab è composta da VH, VL, CL e CH1, che possono rapidamente selezionare anticorpi ideali con elevata affinità. L'unità più piccola in grado di legare l'antigene bersaglio VHH costituisce attualmente la libreria di nanobody. VHH presenta i vantaggi di una struttura semplice, un volume ridotto, un'elevata solubilità, una buona stabilità e una facile preparazione ed espressione. Le librerie di nanobody sintetici (Nb) stanno emergendo come un'alternativa interessante all'immunizzazione animale per i nanobody sintetici stabili e ad alta affinità. In genere, questi frammenti di anticorpi sono fusi al G3P del fago M13 e, clonando un gran numero di geni che codificano un frammento di anticorpo, è possibile generare grandi librerie di anticorpi phage display da cui è possibile selezionare molti anticorpi diversi.

Al termine dell'immunizzazione, è stato rilevato il titolo anticorpale e, una volta qualificato, è stato prelevato un campione di sangue animale. I linfociti sono stati isolati dal sangue, l'RNA è stato estratto, la RT-PCR ha amplificato il frammento bersaglio e si è ottenuto il frammento del gene della regione V. Il gene V è stato amplificato utilizzando un primer specifico.

Le librerie naturali create includono anticorpi immunogenici deboli negli animali, in grado di colpire qualsiasi bersaglio. Gli anticorpi fagici che si legano specificamente all'antigene possono essere raccolti utilizzando tecniche di screening che fissano o marcano l'antigene.

L'antigene bersaglio viene fissato a un supporto solido, come il foro di una micropiastra, o accoppiato a una biglia magnetica. La libreria di anticorpi fagici viene quindi aggiunta per legarla all'antigene. Dopo molteplici eluizioni, i fagi a bassa affinità o aspecifici vengono lavati via e quelli che presentano anticorpi specifici vengono trattenuti.