Servizio di screening della libreria di fagi (Phage Display Library)
Alpha Lifetech è da molti anni profondamente impegnata nella tecnologia del phage display. Ha sviluppato una piattaforma tecnologica per il phage display perfettamente stabile che consente di risparmiare tempo nella ricerca scientifica o nello sviluppo di progetti, facilitando al contempo la successiva produzione. Alpha Lifetech offre inoltre ai propri clienti servizi quali la produzione di anticorpi VHH, anticorpi scFv e anticorpi Fab.
Alpha Lifetech dispone di una piattaforma completa di visualizzazione su fagi M13/T7 per garantire la costruzione e la produzione di librerie di anticorpi. Possiamo inoltre fornire servizi personalizzati, come la produzione di anticorpi scFv e lo screening di anticorpi ad alto rendimento, per soddisfare le vostre esigenze.
Processo di costruzione della libreria di fagi
Il processo di costruzione della libreria fagica è il seguente: vengono progettati primer specifici per l'amplificazione PCR che consentono di ottenere i prodotti, i quali vengono ligati enzimaticamente al vettore fagico T7/M13, e si ottiene così il plasmide fagico ricombinante. Il plasmide fagico ricombinante viene trasformato in cellule recettrici TG1, quindi immobilizzato su un terreno contenente antibiotici appropriati e, dopo lo screening dei trasformanti, si procede all'espansione della coltura. Dopo diversi cicli di coltura, il fago si replica un numero sufficiente di volte nei batteri ed esprime con successo la proteina o il polipeptide bersaglio. Infine, la libreria fagica viene purificata per rimuovere eventuali impurità e fagi non legati.
Metodi di screening per librerie di fagi a visualizzazione.
Il successo della produzione di anticorpi tramite phage display dipende principalmente dalle librerie di anticorpi phage display, e i metodi più comuni di phage panning sono lo screening in fase solida e in fase liquida. Lo screening antigenico in fase solida arricchisce gli anticorpi specifici attraverso 3-4 cicli di eluizione per ottenere librerie di anticorpi phage display; lo screening antigenico in fase liquida viene eseguito incubando librerie di anticorpi e fagi display marcati con biotina e catturando i fagi legati mediante microsfere magnetiche. Lo screening in fase solida consuma più antigene e alcuni epitopi antigenici vengono distrutti. Lo screening in fase liquida è caratterizzato da elevata efficienza e arricchimento, ma gli anticorpi ottenuti sono meno specifici. Il metodo di phage panning dipende dalle esigenze sperimentali, che avranno tutte un certo impatto sull'efficacia della produzione di anticorpi tramite phage display.
Screening anticorpale ad alta produttività
Lo sviluppo di anticorpi ha subito una rapida accelerazione nella medicina moderna. Esistono diversi metodi di sviluppo degli anticorpi, ma lo screening ad alto rendimento è quello più utilizzato in ambito medico. Questo processo permette di ottenere un'ampia varietà di repertori anticorpali. La combinazione con i metodi tradizionali di screening di librerie di anticorpi può migliorare la qualità dello screening delle librerie di fagi. Dopo lo screening biologico, gli anticorpi possono essere caratterizzati mediante ELISA a basso rendimento o screening ad alto rendimento.
Precauzioni per lo screening con display fagico di anticorpiPrecauzioni
Considerazioni sul buffer
La scelta dei tamponi deve tenere conto della stabilità del target, del microambiente di legame e della minimizzazione del legame non specifico nello scenario applicativo reale. Proteine non correlate, detergenti non ionici e concentrazioni saline fisiologiche contribuiscono a ridurre il rumore di fondo. Esistono anche altre condizioni, come ad esempio la possibilità che alcuni target richiedano l'aggiunta di cationi bivalenti o altri cofattori al tampone; i cofattori proteici possono essere co-fissati con il target, aggiunti al tampone di separazione e persino utilizzati come mezzo per catturare il target.
Considerazioni sulla pressione
Tra i fattori comunemente considerati per aumentare la pressione selettiva vi sono la concentrazione delle molecole bersaglio, il tempo di legame, l'intensità del lavaggio, ecc. Altre tecniche per incrementare la pressione selettiva includono l'uso di agenti denaturanti (come acidi, urea e guanidina), solventi organici, l'aumento della temperatura o l'incremento della concentrazione di ligandi o bersagli concorrenti nel tampone di lavaggio.
Tra queste fasi, la prima fase di screening è fondamentale. L'obiettivo di questa prima fase è catturare il maggior numero possibile di cloni positivi dalla libreria costruita, eliminando al contempo i cloni non specifici. Per garantire la cattura di un elevato numero di fagi legati e mantenere la diversità della libreria, è opportuno utilizzare target con rivestimento poroso o un gran numero di target solubili. Nelle fasi successive di screening, la pressione selettiva dovrebbe essere aumentata con l'incremento dell'arricchimento, lavaggi multipli e tempi di lavaggio prolungati, consentendo così di selezionare i cloni con elevata affinità.
Strategia di screening negativo
Per quanto riguarda i tag antigenici e i materiali di supporto, il processo di screening consiste nel rilevare tutte le sostanze presenti sui coniugati antigenici, come tag, proteine di fusione e substrati di supporto. Lo screening negativo dei non-target può limitare l'arricchimento di anticorpi diversi dall'antigene bersaglio.
Cellule intere, liposomi, dischi di nanofosfolipidi e VLP possono essere sottoposti a screening negativo utilizzando cellule transfettate simulate o cellule non transfettate durante lo screening di linee cellulari transfettate.
Rimozione di miscele antigeniche complesse. È possibile eseguire uno screening negativo rigoroso per molecole bersaglio sconosciute o complesse, come cellule intere o proteine impure.
La strategia degli anticorpi contro siti specifici degli antigeni consiste, in due modi: uno, eluire l'anticorpo in grado di competere con il ligando aggiungendo un'alta concentrazione di ligandi; l'altro, bloccare l'anticorpo.
Applicazione del phage display
La scoperta di anticorpi è diventata sempre più importante nella medicina moderna. Esistono diversi approcci per la scoperta di anticorpi, ma la tecnologia del phage display è la più utilizzata nella scienza medica. Dal 1990, sono stati utilizzati diversi formati di anticorpi per costruire librerie di fagi, tra cui VH, VHH, scFv, diabody e anticorpi Fab.
*Le librerie di peptidi fagici consentono la rapida determinazione della sequenza degli epitopi proteici e sono diventate un potente strumento per studiare l'interazione tra epitopi e recettori antigenici.
*I frammenti di anticorpi vengono fusi alla proteina G3P del fago M13 e, clonando un gran numero di geni che codificano per un frammento di anticorpo, è possibile generare ampie librerie di anticorpi a display fagico da cui selezionare numerosi anticorpi diversi.
*Il sistema di visualizzazione del fago T7 presenta numerosi vantaggi, tra cui semplicità, elevata sicurezza, stabilità, facilità di stoccaggio e trasporto, pertanto viene utilizzato nei vaccini preventivi e terapeutici.
*Il sistema di visualizzazione del fago T7 è in grado di rilevare diversi antigeni, come gli antigeni di superficie dei microrganismi patogeni e gli antigeni tumorali.