Leave Your Message
diapositiva 1

Servizio di screening della libreria Phage Display

La tecnologia di screening mediante fago display è stata applicata in campi quali la trasduzione del segnale cellulare, i siti di riconoscimento delle proteine ​​e lo sviluppo di farmaci, oltre allo studio degli epitopi antigenici.
CONTATTACI
01

Servizio di screening della libreria Phage Display

Alpha Lifetech è impegnata da molti anni nella tecnologia Phage Display. Ha sviluppato una piattaforma tecnologica Phage Display stabile e perfetta che consente di risparmiare tempo nella ricerca scientifica o di progetto e di facilitare la successiva produzione. Alpha Lifetech può anche fornire ai clienti servizi come la produzione di anticorpi VHH, scFV e Fab.
Alpha Lifetech dispone di una piattaforma completa per il fago display M13/T7 per garantire la costruzione e la produzione di librerie anticorpali. Possiamo anche fornire servizi personalizzati, come la produzione di anticorpi scFv e lo screening anticorpale ad alto rendimento, per soddisfare le vostre esigenze.

Processo di costruzione della libreria Phage Display

Il processo di costruzione della libreria fagica è il seguente: vengono progettati primer specifici per l'amplificazione tramite PCR che produce i prodotti, che vengono legati enzimaticamente con il vettore fagico T7/M13, e il plasmide fagico ricombinante viene costruito con successo. Il plasmide fagico ricombinante viene trasformato in cellule recettoriali TG1, quindi rivestito con un terreno contenente antibiotici appropriati, e la coltura espansa è stata eseguita dopo lo screening dei trasformatori. Dopo diversi cicli di coltura, il fago replica i tempi di replicazione nei batteri ed esprime con successo la proteina o il polipeptide target. La libreria fagica viene quindi purificata per rimuovere alcune impurità e fagi non legati.

Metodi di screening della libreria Phage Display

Il successo della produzione di anticorpi per il phage display dipende principalmente dalle librerie di anticorpi per il phage display, e i metodi più comuni di phage panning sono lo screening in fase solida e in fase liquida. Lo screening antigenico in fase solida arricchisce anticorpi specifici attraverso 3-4 cicli di eluizione per ottenere librerie di anticorpi per il phage display; lo screening antigenico in fase liquida viene eseguito incubando librerie di anticorpi e target per il phage display marcate con biotina e catturando i fagi legati tramite biglie magnetiche. Lo screening in fase solida consuma più antigene e alcuni epitopi antigenici vengono distrutti. Lo screening in fase liquida è caratterizzato da elevata efficienza e arricchimento, ma gli anticorpi ottenuti sono meno specifici. Il metodo di phage panning dipende dalle esigenze sperimentali, che avranno tutte un certo impatto sull'effetto della produzione di anticorpi per il phage display.

Screening di anticorpi ad alto rendimento

Lo sviluppo di anticorpi è in rapida evoluzione nella medicina moderna. Esistono diversi metodi di sviluppo di anticorpi, ma lo screening anticorpale ad alta processività è maggiormente utilizzato in ambito medico. Il processo consente di ottenere un'ampia diversità del repertorio anticorpale. La combinazione con i tradizionali metodi di screening delle librerie anticorpali può migliorare la qualità dello screening delle librerie phage display. Dopo lo screening biologico, gli anticorpi possono essere caratterizzati mediante ELISA a bassa processività o screening anticorpale ad alta processività.
Immagine 2
Fig.1 Diagramma di flusso che delinea la sequenza di eventi dalla costruzione di librerie di anticorpi fagici alla generazione di anticorpi monoclonali con elevata affinità per gli antigeni e bassa immunogenicità.(Fonte di riferimento:La tecnologia Phage Display come potente piattaforma per la scoperta di farmaci anticorpali- PMC (nih.gov))

Precauzioni per lo screening con anticorpo fago displayPrecauzioni

Considerazioni sul buffer

La selezione dei tamponi deve tenere conto della stabilità del target, del microambiente di legame e del legame aspecifico minimo nello scenario applicativo effettivo. Proteine ​​non correlate, detergenti non ionici e concentrazioni saline fisiologiche contribuiscono a ridurre il background. Esistono anche altre condizioni, ad esempio alcuni target potrebbero richiedere l'aggiunta di cationi bivalenti o altri cofattori al tampone, i cofattori proteici possono essere co-fissati con il target, possono essere aggiunti al tampone di smistamento e possono persino essere utilizzati come mezzo per catturare il target.

Considerazioni sulla pressione

Le considerazioni comuni sulla pressione di selezione includono la concentrazione delle molecole target, il tempo di legame, l'intensità del lavaggio, ecc. Altre tecniche per aumentare la pressione di selezione includono l'uso di denaturanti (come acidi, urea e guanidina), solventi organici, l'aumento della temperatura o l'aumento della concentrazione di ligandi o target concorrenti nel tampone di lavaggio.
Tra questi, il primo ciclo di screening è importante. Il primo ciclo di screening consiste nell'acquisizione del maggior numero possibile di cloni positivi dalla libreria costruita, rimuovendo al contempo i cloni non specifici. È opportuno utilizzare bersagli con rivestimento poroso o un gran numero di bersagli solubili per garantire la cattura di un elevato numero di fagi legati e preservare la diversità della libreria. Nei cicli successivi di screening, la pressione di selezione deve essere aumentata con l'aumento dell'arricchimento, lavaggi multipli e tempi di lavaggio più lunghi, in modo da poter selezionare i cloni ad alta affinità.

Strategia di screening negativo

Tag antigenici e materiali di supporto: il processo di screening consiste nello screening di tutte le sostanze presenti sui coniugati antigenici, come tag, proteine ​​di fusione e substrati di supporto. Lo screening negativo di anticorpi non target può limitare l'arricchimento di anticorpi diversi dall'antigene target.
Cellule intere, liposomi, dischi nanofosfolipidici e VLP possono essere sottoposti a screening negativo utilizzando cellule transfettate simulate o cellule non transfettate durante lo screening di linee cellulari transfettate.
Rimozione di miscele di antigeni complessi È possibile eseguire uno screening negativo rigoroso per molecole bersaglio sconosciute o complesse, come cellule intere o proteine ​​impure.
La strategia degli anticorpi contro siti specifici di antigeni consiste nell'eluare l'anticorpo che può competere con il ligando aggiungendo un'elevata concentrazione di ligandi, mentre l'altra consiste nel bloccare l'anticorpo.

Applicazione del Phage Display

*La scoperta di anticorpi è diventata sempre più importante nella medicina moderna. Esistono diversi approcci per la scoperta di anticorpi, ma la tecnologia "phage display" è maggiormente utilizzata in ambito medico. Dal 1990, sono stati utilizzati diversi formati di anticorpi per costruire librerie fagiche, tra cui VH, VHH, scFv, diabodies e anticorpi Fab.
*Le librerie di peptidi fagici consentono la rapida determinazione della sequenza degli epitopi proteici e sono diventate un potente strumento per indagare l'interazione tra epitopi e recettori antigenici
*I frammenti di anticorpi sono fusi al G3P del fago M13 e, clonando un gran numero di geni che codificano un frammento di anticorpo, è possibile generare grandi librerie di anticorpi phage display da cui è possibile selezionare molti anticorpi diversi.
*Il sistema di visualizzazione dei fagi T7 presenta numerosi vantaggi, tra cui semplicità, elevata sicurezza, stabilità, facile conservazione e trasporto, per cui il sistema viene utilizzato nei vaccini preventivi e terapeutici.
*Il sistema di visualizzazione dei fagi T7 può rilevare vari antigeni, come gli antigeni di superficie di microrganismi patogeni e gli antigeni tumorali.

I nostri casi di servizio

SERVIZIO

If you have any questions, please feel free to contact us at any time.

Leave Your Message

Servizio in evidenza