Servizio di analisi delle interazioni proteina-proteina
Alpha Lifetech può inoltre fornire ai clienti analisi delle proteine, analisi delle interazioni proteiche, analisi delle interazioni proteina-proteina (CO-IP, Western Blot, analisi di immunoprecipitazione della cromatina) e analisi della funzione proteica per soddisfare le esigenze sperimentali di diversi clienti.
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Servizio di analisi delle interazioni proteina-proteina
Alpha Lifetech è impegnata da molti anni nel campo delle analisi proteiche, ha creato una solida piattaforma per le analisi della funzione proteica e ha padroneggiato una serie di mezzi tecnici per verificare l'interazione proteica, il che può far risparmiare tempo alla ricerca scientifica o alla ricerca di progetti, fornendo al contempo risultati stabili.
Alpha Lifetech può inoltre fornire ai clienti analisi delle proteine, analisi delle interazioni proteiche, analisi delle interazioni proteina-proteina (CO-IP, Western Blot, analisi di immunoprecipitazione della cromatina) e analisi della funzione proteica per soddisfare le esigenze sperimentali di diversi clienti.
Introduzione al test di interazione proteina-proteina
Le proteine sono le molecole esecutive più importanti in qualsiasi forma di vita, in quanto rispondono alle istruzioni contenute nel materiale genetico. Più frequentemente, le proteine svolgono il loro compito agendo come attori di ruolo che interagiscono con altre proteine, il che è più evidente quando la funzione di una proteina viene esaminata nel contesto reale di una cellula. Identificare le interazioni tra proteine è fondamentale per l'indagine biochimica di una singola proteina. L'analisi delle interazioni proteiche di tipi comuni è la seguente:
Test di co-immunoprecipitazione
Il principio del metodo di co-immunoprecipitazione è quello di mescolare la proteina bersaglio, l'anticorpo specifico e le sfere magnetiche della proteina A/G per l'incubazione; il surnatante della proteina non legata viene scartato tramite l'adsorbimento delle sfere magnetiche sul supporto magnetico e le sfere magnetiche vengono lavate per rimuovere la proteina e altre impurità, a meno che non siano specificamente legate.
Fig.1 Diagramma schematico dei test Co-IP.(Fonte di riferimento: Saggio di coimmunoprecipitazione - PubMed (nih.gov))
Saggio pull-down
Il test pull-down consiste nel fissare la proteina nota sulla biglia magnetica e aggiungere la sostanza da rilevare. L'eluente viene rilevato per l'adsorbimento delle proteine interagenti.
Nel 1988, Smith et al. hanno purificato la proteina di fusione GST, che è stata applicata nei test pull-down ed è chiamata Gst pull down, ovvero aggiunge un tag GST alla proteina bersaglio, cattura la proteina interagente tramite GSH, eluisce il legame e lo verifica tramite test WB.
Fig.2 Diagramma schematico dei test pull-down GST.(Fonte di riferimento: Saggio GST Pull-Down per studiare il legame PIF4 in vitro - PubMed (nih.gov) )
Il suo metodo consiste nell'utilizzare ioni metallici come nichel o cobalto come mezzo, purificare la proteina tramite cromatografia di affinità ed eluare il legame tramite esperimento WB per la verifica.
Esistono inoltre il test DNA Pull-down (test di legame proteina-DNA), il test RNA Pull-down (test di interazione proteina-RNA) e il test small molecule pull-down.
Il DNA Pull-down (test di legame tra proteine e DNA) è un metodo in vitro per determinare il legame delle proteine al DNA. I test WB hanno rilevato se specifiche proteine si legano al DNA bersaglio; frammenti di DNA sconosciuti legati alle proteine, i quali sono noti tramite rilevamento tramite spettroscopia di spettroscopia.
L'RNA Pull-down (saggio di interazione proteina-RNA) è un metodo in vitro per determinare il legame dell'RNA alle proteine. I saggi WB hanno rilevato se specifiche proteine si legano all'RNA bersaglio; frammenti di RNA sconosciuti legati alle proteine, quali frammenti di RNA sono noti tramite rilevamento MS.
Il test SM pull-down (saggi di pull-down di piccole molecole) può individuare proteine bersaglio che si legano specificamente a piccole molecole e, se combinato con MS, consente di selezionare accuratamente le proteine bersaglio di piccole molecole, il che può essere suddiviso nel metodo di marcatura in vitro e nel metodo ortogonale biologico.
Esperimento WB
Esperimento WB (noto anche come esperimento Western Blot o Western Blot), l'essenza è la reazione specifica di antigene e anticorpo. Il principio di base è la separazione delle proteine denaturate tramite elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS e il loro trasferimento su un supporto in fase solida (come membrana PVDF, membrana NC) tramite trasferimento di membrana (rotazione a umido o semi-secco). Dopo il blocco (utilizzando BSA, latticello, ecc.), l'anticorpo primario viene applicato per legarsi specificamente alla proteina e l'anticorpo secondario marcato con fluoresceina viene aggiunto dopo aver lavato la pellicola. Legando il secondo anticorpo con l'anticorpo primario, la proteina bersaglio può essere osservata tramite lo sviluppo del colore del substrato e la chemiluminescenza. Viene generalmente utilizzato per determinare se una proteina specifica è espressa nel campione e analizzarne approssimativamente il livello di espressione.
Confronto del metodo di interazione proteina-proteina
I test pull-down proteici sono simili ai test Co-IP, entrambi appartenenti alla rilevazione di esperimenti di interazione proteica. La differenza tra i due metodi è che i test Co-IP ottengono le proteine interagenti di proteine note, il che ha una certa autenticità ma non può confermare se le proteine interagenti interagiscono direttamente o indirettamente. I test pull-down servono a trovare la proteina sconosciuta che interagisce con la proteina nota. Possono confermare direttamente se la proteina nota interagisce con la proteina rilevata, ma non possono conoscere la situazione di legame in vivo.
La tecnologia di co-immunoprecipitazione viene utilizzata per analizzare se esiste un'interazione tra due o più proteine, sulla base di esperimenti di immunoprecipitazione. Rispetto ad altre analisi di interazione proteica di tecniche sperimentali (GST Pull-down, Western Blot, saggio di immunoprecipitazione della cromatina, ecc.), la tecnologia Co-IP ha una specificità, una sensibilità e un'elevata ripetibilità più elevate, che possono evitare l'interferenza di legami non specifici e riflettere l'interazione delle proteine nello stato naturale.
| GST Tirare verso il basso | Co-IP | WB | |
|---|---|---|---|
| Vantaggio | *Facile da usare *Adatto per la purificazione di varie proteine | *Per l'analisi dell'interazione in vivo *Può essere identificato con la proteina a valle | *Forte specificità *Qualitativo e quantitativo in vitro |
| Limitazione | *Forse legame non specifico *È richiesta un'ulteriore convalida dell'interazione | *Forte dipendenza dagli anticorpi *Potrebbe verificarsi un legame non specifico | *Richiede tempo *Difficile da usare per analisi proteiche su larga scala |
| Esempio di applicazione | *Identificare le interazioni *Complesso proteico purificato | *Studio della trasduzione del segnale *Meccanismo della malattia | Analisi successiva delle interazioni proteina-proteina, proteina-DNA e proteina-RNA |
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16/07/2018 
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