Piattaforma di ordinamento di singole cellule B

Anticorpo monoclonale (mAb): pioniere dei farmaci anticorpali, oltre 100 anticorpi monoclonali sono stati approvati per il trattamento di cancro, malattie infettive, sviluppo di farmaci propri e dimostrano il loro valore terapeutico unico. La tecnologia degli anticorpi a singola cellula B, come nuova generazione di tecnologia di sviluppo di anticorpi, può isolare in modo efficiente e rapido gli anticorpi da singole cellule B, rappresentando una svolta nella tecnologia di produzione di anticorpi dopo ibridoma e phage display. La tecnologia di smistamento delle singole cellule B può essere utilizzata per la generazione di anticorpi contro diverse specie come conigli, topi, cammelli, pecore e polli. La tecnologia a singola cellula B presenta vantaggi eccezionali come elevata specificità, elevata attività e elevata affinità. Basandosi sulla piattaforma di smistamento delle singole cellule B, Alpha Lifetech offre vantaggi in termini di tempi di screening e ottenimento di anticorpi di alta qualità. Può fornire progettazione, sintesi e modifica di antigeni, immunità animale, screening di arricchimento delle singole cellule B, sequenziamento di singole cellule, screening ad alto rendimento, espressione e purificazione, servizi tecnici completi come la verifica funzionale per soddisfare le diverse esigenze dei clienti.

Riepilogo delle tecniche di screening delle singole cellule B

I metodi di screening delle singole cellule B si dividono principalmente in metodi di isolamento casuale e isolamento selettivo antigene. La separazione casuale è applicabile a campioni con elevata concentrazione di isolamento selettivo antigene e vengono separate solo le cellule B. È semplice da utilizzare ma richiede molto lavoro ed è spesso utilizzato come primo passaggio della separazione antigene-specifica. Il metodo di separazione antigene-specifica è adatto a situazioni in cui il contenuto di anticorpi specifici, come anticorpi antitumorali e anticorpi autoimmuni, è basso. È relativamente complesso isolare cellule B specifiche utilizzando il principio immunologico del legame specifico di antigene e anticorpo all'originale. I metodi di classificazione comunemente utilizzati e i relativi vantaggi e svantaggi sono riportati nella tabella.

	Approcci	Vantaggi	Svantaggi
Casuale Isolamento	Micromanipolazione	Bassi requisiti di attrezzatura Funzionamento semplice	Bassa efficienza Tipi limitati di cellule isolate
	Microdissezione con cattura laser	Elevata precisione di posizione Funzionamento semplice Selezionare visivamente le cellule simili dal campione e rimuovere le impurità	Processo complicato di preparazione del campione Impossibilità di automatizzare
	Ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza	Elevata precisione ed efficienza Alto grado di automazione Ampia applicazione	Operazione complicata Elevati requisiti di equipaggiamento
Isolamento selettivo dell'antigene	Antigeni marcati con fluorocromo tramite multiparametro	Elevata precisione ed efficienza Alto grado di automazione Alta produttività e multiparametro Capacità di isolare le cellule B in diverse fasi	Operazione complicata Elevati requisiti di equipaggiamento
	Perle magnetiche rivestite di antigene	Funzionamento semplice Alta ripetibilità Può arricchire le cellule B bersaglio	Operazione complicata Le sfere magnetiche influenzano l'attività biologica delle cellule e non favoriscono la coltura e il funzionamento dopo l'isolamento
	Microincisione	Alta efficienza Ad alta velocità	Elevati requisiti di equipaggiamento Bassa efficienza
	Saggio array Immunospot su chip	Alto grado di automazione Elevata precisione ed efficienza	Operazione complicata Costo elevato

Processo di servizio di screening degli anticorpi delle singole cellule B

Immunizzazione degli animali

Selezionare l'antigene appropriato per gli animali da esperimento (come topi, conigli, ecc.) per la stimolazione immunitaria, in modo che possano produrre anticorpi specifici contro l'antigene.

L'immunizzazione animale è la fase iniziale della produzione di anticorpi. L'immunizzazione animale sfrutta il meccanismo di risposta immunitaria umorale dell'organismo stesso: attraverso la continua stimolazione di antigeni, gli animali producono una forte risposta immunitaria e quindi secernono anticorpi specifici contro antigeni specifici.

Raccolta e arricchimento delle cellule B

Le cellule B sono state isolate dal sangue periferico, dalla milza o dai linfonodi di animali immuni. Queste cellule B sono state immunologicamente stimolate a produrre anticorpi contro antigeni specifici.

Attraverso metodi fisici o chimici (come la centrifugazione in gradiente di densità, la separazione con sfere magnetiche, ecc.), l'arricchimento delle cellule B, la rimozione delle cellule impure, migliorano la purezza delle cellule B e l'efficienza della successiva separazione.

Fig. 1 Clonazione e preparazione dell'anticorpo monoclonale di coniglio. Fonte di riferimento:Clonazione di singole cellule B e produzione di anticorpi monoclonali di coniglio.)

ordinamento delle cellule B

La separazione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS), la separazione cellulare magnetica (MACS), la separazione cellulare microfluidica (MCS) o altre tecniche di screening ad alto rendimento, combinate con l'etichettatura specifica dell'antigene, possono essere utilizzate per selezionare singole cellule B da cellule B arricchite per produrre anticorpi mirati.

Quando una singola cellula B viene isolata da una popolazione mista di cellule B, i suoi geni anticorpali devono essere sequenziati mediante la tecnologia di sequenziamento a singola cellula e analizzati per ottenere le informazioni sulla sequenza del DNA della regione variabile della catena pesante (VH) e della regione variabile della catena leggera (VL). La tecnologia di sequenziamento a singola cellula comprende principalmente tre fasi: isolamento della singola cellula, amplificazione intracellulare degli acidi nucleici e analisi del sequenziamento. Il principio del sequenziamento a singola cellula è quello di amplificare il DNA o l'RNA dell'intero genoma di singole cellule isolate per ottenere un genoma o un trascrittoma completo con elevata copertura per il sequenziamento ad alto rendimento.

Attraverso lo screening ad alto rendimento, è possibile ottenere contemporaneamente sequenze geniche di anticorpi di migliaia di cellule B, accelerando notevolmente la scoperta di anticorpi. Queste informazioni sulla sequenza possono essere ulteriormente utilizzate per la costruzione e lo screening di librerie di anticorpi.

Fig.2 Diagramma schematico della cattura di singole cellule B, costruzione di librerie, screening ad alto rendimento e sequenziamento.(Fonte di riferimento: Il sequenziamento massivo parallelo del recettore delle cellule B a singola cellula consente la rapida scoperta di diversi anticorpi reattivi all'antigene.)

Amplificazione del gene dell'anticorpo

Una singola cellula B viene scissa per rilasciare mRNA. Quindi, le sequenze di cDNA della regione variabile della catena pesante (VH) e della regione variabile della catena leggera (VL) vengono amplificate mediante reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa (RT-PCR).

Espressione e purificazione degli anticorpi

Il gene della regione variabile amplificato è stato inserito nel plasmide vettore con il gene della regione costante per costruire il plasmide di espressione dell'anticorpo monoclonale. Quindi, il sistema di espressione appropriato (sistema di espressione eucariotico come le cellule CHO o sistema di espressione procariotico come Escherichia coli) è stato selezionato per l'espressione e si è ottenuto l'anticorpo monoclonale con attività biologica. La cromatografia di affinità per proteina A è stata utilizzata per estrarre e purificare gli anticorpi espressi dalla coltura cellulare e ottenere anticorpi monoclonali ricombinanti di alta qualità.

Validazione degli anticorpi

La convalida degli anticorpi in termini di specificità, affinità e attività biologica mediante ELISA, Western Blot, analisi di flusso e immunoprecipitazione garantisce che le prestazioni degli anticorpi siano all'altezza delle aspettative. La convalida degli anticorpi è un passaggio fondamentale per garantire la qualità e l'affidabilità degli anticorpi.

Requisiti per l'immunogeno

(1) Proteina ricombinante: ≥2,5 mg, purezza proteica >85%, peso molecolare proteico superiore a 10 kDa, concentrazione proteica solubile compresa tra 0,5 e 5 mg/mL. Se è richiesta la purificazione dell'affinità antigenica, sono necessari ulteriori 10 mg di proteina ricombinante.

(2)Polipeptidi e piccole molecole: peptide nudo ≥10 mg, purezza del peptide >90%, non meno di 10 AA, accoppiamento KLH/BSA/OVA o altre proteine trasportatrici; le piccole molecole richiedono una valutazione strutturale preventiva.

Flusso di lavoro del servizio di ordinamento delle singole cellule B

Passi	Contenuto del servizio	Cronologia
Fase 1: Immunizzazione degli animali e rilevamento ELISA	(1) Gli animali sono stati immunizzati 4-5 volte, a partire dalla quarta dose, il siero è stato raccolto per la rilevazione ELISA del titolo anticorpale (titolo sierico ELISA dell'antigene proteico >10^5; titolo sierico ELISA dell'antigene peptidico >10^4). Contemporaneamente, 0,1 ml di siero pre-immunizzazione e post-immunizzazione vengono inviati ai clienti per i test; se il titolo non è qualificato, l'immunizzazione continuerà o il cliente richiederà la cessazione del progetto e verrà addebitata solo la parte relativa all'immunizzazione; (2)Se il titolo era qualificato, le cellule PBMC venivano isolate dal sangue intero.	10-12 settimane
Fase 2: Ordinamento delle singole cellule B	(1) È stata raccolta la milza, è stata preparata una sospensione di singole cellule B, è stato raccolto il sangue periferico e sono state isolate le cellule PBMC. (2) Marcatori immunoantigenici FITC e AF648. (3) Doppio flusso di fluorescenza + coltura di un singolo clone di cellule B. (4) Identificazione ELISA + sequenziamento dei cloni positivi.	2-3 settimane
Fase 3: Espressione e convalida degli anticorpi	(1) Sintesi genica di 6-10 sequenze + validazione del test di espressione nei mammiferi. (2) Identificazione ELISA.	3-4 settimane
Fase 4: Consegna	(1) Sequenze di anticorpi: 4-6 sequenze di anticorpi (le sequenze non espresse vengono fornite insieme). (2) Ogni sequenza espressa ha rilasciato 0,2 mg di anticorpo. (3) Rapporto sperimentale.	1 settimana