Servizio di screening della libreria di vetrini per la visualizzazione superficiale del lievito

Alpha Lifetech è specializzata nella costruzione di librerie di lievito e nello screening di librerie di anticorpi, offrendo la possibilità di generare diverse forme di librerie di lievito e di sottoporle a screening per anticorpi ad alta affinità e specifici per clienti in tutto il mondo. Grazie a un team di ricercatori esperti, tecnologie e attrezzature all'avanguardia, siamo in grado di costruire librerie di lievito mirate a un'ampia gamma di proteine correlate a malattie. Possiamo fornire tecnologie di phage display e yeast display, tra cui yeast display di proteine, di piccole molecole, di anticorpi, ecc.

Le nostre librerie di visualizzazione su lievito hanno una grande capacità e un'elevata diversità, che forniscono una solida base per lo screening efficace di specifiche sequenze anticorpali. Possiamo costruire diverse tipologie di librerie di visualizzazione di anticorpi su lievito (IgG, scFv, VHH, Fab), librerie proteiche, librerie di peptidi, librerie di cDNA, ecc., in base alle vostre esigenze. Inoltre, possiamo anche sviluppare librerie di anticorpi con varie proprietà, tra cui librerie immunitarie, librerie naturali, librerie sintetiche, librerie semisintetiche e librerie di anticorpi specifici per malattie.

Introduzione al sistema di esposizione del lievito

La tecnologia di visualizzazione sulla superficie del lievito è un metodo per esporre proteine ricombinanti sulla superficie del lievito tramite fusione genica. Il sistema di visualizzazione su lievito più comune utilizza la proteina bersaglio fusa all'estremità C-terminale della subunità Aga2p della proteina di accoppiamento alfa-lectina, costituita principalmente da tag epitopici su entrambi i lati della proteina bersaglio: il tag emoagglutinina (HA) di 9 amminoacidi all'estremità N-terminale e il tag c-myc di 10 amminoacidi all'estremità C-terminale. La subunità Aga2p di 69 amminoacidi si lega alla subunità Aga1p dell'alfa-lectina di 725 amminoacidi tramite due legami disolfuro, e Aga1p è ancorata alla parete cellulare tramite un legame covalente β 1,6-glucano. Pertanto, la proteina bersaglio viene esposta sulla superficie delle cellule di lievito e successivamente riconosciuta dal ligando corrispondente. Le proteine funzionali vengono separate dalle librerie tramite screening con citometria a flusso.

Figura 1: Principio di visualizzazione superficiale del lievito. (Fonte della figura: Applicazioni della visualizzazione superficiale del lievito nell'ingegneria proteica.)

Introduzione alla libreria di visualizzazione superficiale del lievito

La selezione basata sull'esposizione di molecole sulla superficie del lievito è utilizzata principalmente per lo screening di librerie di anticorpi che prendono di mira le proteine della superficie cellulare. Grazie al basso legame non specifico tra le cellule di lievito e le altre superfici cellulari, la selezione biologica del lievito consente di analizzare ampie librerie di legame per individuare cloni rari.

Servizio di screening della libreria di vetrini per la visualizzazione superficiale del lievito

Si preparano i plasmidi e si coltivano le cellule di lievito, si sintetizza il DNA che codifica per la proteina bersaglio e lo si clona in un vettore di espressione per lievito contenente promotori inducibili, peptidi segnale e geni bersaglio fusi a proteine di superficie (come Aga2p). Il gene che codifica per la proteina bersaglio può essere fuso con il gene che codifica per la proteina della parete cellulare del lievito (solitamente Aga2p) e il gene fuso può essere trasformato nelle cellule di lievito tramite elettroporazione. Dopo la trasformazione, le cellule di lievito che esprimono i geni anticorpali sulla loro superficie possono essere sottoposte a test di screening antigene-specifici: la libreria di lievito viene incubata con l'antigene bersaglio e vengono selezionate le cellule di lievito che si legano specificamente ad esso. Utilizzando la citometria a flusso (FACS) per isolare le cellule di lievito che esprimono proteine con le caratteristiche desiderate, lo screening della libreria di lievito può essere eseguito con una dimensione massima della libreria di circa 10^8-10^9 cellule di lievito. I cloni positivi possono quindi essere isolati per ulteriori analisi o applicazioni a valle. Una volta identificati specifici cloni di anticorpi nella libreria di anticorpi, questi possono essere ulteriormente caratterizzati, prodotti in massa e purificati utilizzando tecniche come la cromatografia di affinità con proteina A/G per completare l'intero processo di screening su lievito e produzione di anticorpi.

Processo di screening della libreria di lieviti

Figura 2. Processo di screening della libreria di lieviti.

Flusso di lavoro del servizio di screening della libreria di lieviti.

Passaggi	Contenuto del servizio	cronologia
Preparazione dell'antigene	Tipo di antigene: se il cliente può fornire gli antigeni, i campioni corrispondenti devono essere consegnati secondo il tipo: le proteine ricombinanti richiedono 3-3,5 mg con un requisito di purezza superiore all'85%, le piccole molecole devono essere coniugate con un requisito di purezza superiore al 90%, la sintesi peptidica deve essere coniugata con un requisito di purezza superiore al 90%, i tipi di campioni come i virus devono essere inattivati, l'RNA deve essere ispezionato per prevenire la degradazione e i tipi di antigene sopra indicati possono anche essere personalizzati per la sintesi.	2-3 settimane
Immunità animale	Il numero di immunizzazioni animali è 5 ed è necessario stabilire se aumentare il numero di immunizzazioni in base ai risultati dei test del titolo sierico. Immunità antigenica: potenza antigenica proteica/virale > 10⁵; potenza antigenica peptidica/piccola molecola > 10⁴	5-6 settimane
Preparazione del cDNA stampo	Separare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal plasma, estrarre l'RNA totale (utilizzando un kit di estrazione dell'RNA) e retrotradurlo in cDNA.	1 giorno
Costruzione della biblioteca	Utilizzando il cDNA della libreria come stampo, il gene VHH è stato amplificato mediante due cicli di PCR ed è stato costruito un vettore di visualizzazione su lievito per lo splicing del gene VHH. Il vettore è stato trasformato in cellule di lievito mediante elettroporazione per costruire una libreria di anticorpi. Sono stati selezionati casualmente 48 cloni e identificato il tasso di positività (>90%) utilizzando il metodo PCR; è stata calcolata la capacità della libreria (10^7-10^8), e il sequenziamento NGS è stato utilizzato per determinare il tasso di inserimento corretto della libreria (>90%) e la diversità della libreria.	2 settimane
Proiezione in biblioteca	Predefinito: tre cicli di screening: screening FACS di proteine marcate con fluorescenza, seguito da sequenziamento NGS nel terzo ciclo. I cloni positivi sono stati selezionati per l'espressione indotta da singolo grammo e il rilevamento tramite ELISA. Tutti i cloni positivi sono stati selezionati per il sequenziamento genico e sono state selezionate diverse sequenze della regione CDR.	2-3 settimane
Verifica degli anticorpi	La costruzione di vettori di espressione appropriati per le sequenze anticorpali può facilitare l'espressione degli anticorpi, la purificazione degli stessi, la validazione del legame antigene-anticorpo tramite ELISA e BLI per verificarne l'affinità, e il blocco mediante citometria a flusso per validare la funzione cellulare.	1 settimana

Caso di screening della libreria di esposizione superficiale del lievito

Nella letteratura relativa alla piattaforma di visualizzazione sulla superficie del lievito per la rapida scoperta di nanocorpi con selettività conformazionale, gli autori hanno creato una piattaforma completa per la scoperta di nanocorpi in vitro basata sulla visualizzazione sulla superficie del lievito. In primo luogo, è stata progettata una libreria di nanocorpi sintetici a partire da geni di cammello. La Figura D mostra che il nanocorpo presenta un tag HA all'estremità carbossilica e che successivamente il nanocorpo è fissato covalentemente alla parete cellulare del lievito. La Figura E mostra il processo di screening dei nanocorpi. I lieviti con nanocorpi ad affinità antigenica sono stati isolati, amplificati e selezionati ripetutamente per la presenza di anticorpi mediante FACS. Attraverso questa piattaforma, gli autori hanno scoperto nanocorpi con selettività conformazionale che prendono di mira due diversi GPCR umani.