親和性測定プラットフォーム

Alpha Lifetechは、OctetおよびBiacore-T2000プラットフォームを基盤として、信頼性の高い親和性測定サービスを提供しています。抗体、細胞、タンパク質、低分子化合物など、様々なサンプルの親和性測定に対応可能です。表面プラズモン共鳴（SPR）法やバイオレイヤー干渉（BLI）法など、多様な親和性測定方法をご用意しています。

Alpha Lifetechは、ELISAと親和性測定を組み合わせた、プロフェッショナルで高精度な親和性測定プラットフォームを提供しており、世界中のお客様にプロフェッショナルで効率的、迅速かつ正確な親和性測定結果を提供しています。お客様には、迅速親和性測定と精密親和性測定の2つの方法からお選びいただけます。迅速親和性測定は単一濃度での測定ですが、精密親和性測定では異なる濃度での親和性を測定できます。このプラットフォームは、様々な低分子化合物、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴマー、脂質、バクテリオファージ、ウイルス、細胞間の相互作用の研究に応用されています。親和性測定プラットフォームは、親和性薬剤試験およびスクリーニング、抗体発見の基盤となり、その後の研究を促進します。

結合親和性入門

親和性は、分子間相互作用、親和性薬物アッセイ、および薬物スクリーニングの評価において重要です。分子間相互作用は、L + R = LR という式で表すことができます。ここで、L は遊離リガンド、R は非結合受容体、LR は結合リガンド-受容体複合体を表します。結合反応は分子間相互作用を定義し、反応中に結合状態と非結合状態の間で動的な交換が起こり、平衡に達します。これは、反応の 2 つの速度定数 Kon (結合速度定数) と Koff (解離速度定数) で表すことができます。結合定数 (Ka) の逆数である Kd 値は Koff/Kon であり、反応親和性にとって重要な定数です。したがって、2 つの分子間の結合が強いほど、親和性は高くなります。Kd 値が小さいほど、その逆になります。この方程式は、半対数グラフ上でS字型の曲線として表すことができ、x軸（対数軸）にリガンド濃度、y軸に結合率の境界値をとります。破線は、結合率0.5のKd（1 nM）におけるリガンド濃度を表します。

図1：細胞表面受容体に結合したリガンドの濃度変化を示すシグモイド結合曲線。（参照元： Hunter SA、Cochran JR. タンパク質間相互作用の親和性を決定するための細胞結合アッセイ：技術と考慮事項。）

親和性を決定する方法

ELISA結合親和性アッセイ

抗体親和性の研究に広く用いられている手法はELISA法に基づいており、その特徴は簡便性、迅速性、簡便性、高感度、そして高い特異性です。少量の試薬（抗体と抗原）で済み、精製試薬を必要とせずに抗体親和性を測定できます。抗原を固体表面に固定化し、一次抗体を用いて検出した後、標識された二次抗体が一次抗体と反応し、ELISAリーダーでデータを読み取って分析します。

図2：設計されたペプチドの標的への結合を評価するためのELISA様アッセイ。（参照元： Hajikarimlou, Maryam, et al., 2022. SARS-CoV-2表面タンパク質Sを検出するペプチドを迅速に設計するための計算アプローチ。）

表面プラズモン共鳴（SPR）結合親和性アッセイ

SPR技術は主に屈折率の変化を検出します。従来の光学現象と光の共鳴現象を利用することで、生体分子間の相互作用を検出するバイオセンシング分析技術を構築し、バイオセンシングチップ上でリガンドと分析対象物との相互作用を検出することができます。生体反応中のSPR角度の動的な変化をモニタリングすることで、生体分子間の結合や相互作用に関する特異的な信号を得ることができます。

図3：H10/AGR2結合の表面プラズモン共鳴（SPR）分析。（参照元： Garri, Carolina, et al., 2018. 前方勾配ホモログ2（AGR2）に対する新規ペプチドの同定、特性評価、および応用。）

バイオ層干渉（BLI）結合親和性アッセイ

バイオフィルム干渉技術は、ラベルフリーのリアルタイムモニタリング光学検出技術であり、主に分子間相互作用の包括的な定量分析やタンパク質濃度測定に用いられます。この技術は、プローブ型バイオセンサーを用いて、試料上のバイオフィルムの厚さの変化を直接検出します。干渉スペクトルの変位変化を検出することで、センサー表面で相互作用する生体分子間の結合と解離が検知され、干渉スペクトルのリアルタイム変位（nm）が表示されます。

図4：aLDRGとキチノオリゴ糖間のバイオレイヤー干渉法（BLI）アッセイ。（参照元： Li, Bing, 2023. 菌類共生に関与するArmillaria sp. 541の根状菌糸と菌糸間の比較トランスクリプトームの特徴（LysMドメインに重点を置く）。）

BLI技術とSPR技術の比較

技術名	BLI（バイオ層干渉法）	SPR（表面プラズモン共鳴）
原理	センサー表面における反射光の干渉パターンの変化を測定し、生体層上の光学的厚さの変化を介して分子間相互作用を検出します。リアルタイムの結合曲線（直接測定）を提供します。	センサーチップ表面付近の屈折率の変化（光が金とガラスの界面に接触し、屈折率が変化する現象）を検出することで、分子間の相互作用を測定します。データは共鳴角の変化として反映されます（間接測定）。
メーカー	サルトリウス	GE
楽器	ForteBioバイオセンサー	Open SPR Instrument
システム	ForteBio Octetシステム（分子間相互作用解析用）	TraceDrawer（スウェーデンのRidgeview Instruments社が開発）
利点	1. 幅広いサンプルに対応し、特に低分子化合物の検出において優れた安定性を発揮します（サンプル純度や緩衝液条件に関する要件はそれほど厳しくありません）。SSAチップは結合研究において費用対効果に優れています。 2. SPRと比較して、処理速度が速く、実験時間が短い。	1. 開発の歴史が長く、BLIと比較してより高い感度を提供します。 2. より高い親和性と特異性データを用いて希少または貴重なタンパク質を検出するなど、特定の用途における精度と堅牢性の向上。
デメリット	1. データ精度はSPRと比較して若干低い。 2. 機器の丁寧なメンテナンスが必要です。 3. SSAチップのコストは比較的高い。	1. 非常に小さな分子を検出するための緩衝液条件は厳しく、検出失敗のリスクを高める可能性があります。 2. チップは一般的にBLIで使用されるものよりも高価です。 3. 長時間の実験では、試料の蒸発が問題となる可能性がある。
チップの種類	SSAチップ	NTAチップ

親和性測定の範囲

親和性測定には、抗原抗体（強抗原抗体、弱抗原抗体）、タンパク質-タンパク質、タンパク質-ペプチド、タンパク質-低分子、およびタンパク質DNA/RNA（アプタマー）が含まれます。KDを測定する際には、いずれかのモル濃度を知る必要があります。低分子が結合する場合、一方の分子量は150ダルトン未満であってはなりません。

タイプ	範囲	予防
1. 抗原抗体反応	10⁻⁶～10⁻¹²	ほとんどの抗体のKd値は10^-6～10^-7～10^-9の範囲です。一般的に、高親和性抗体は10^-9以内、低親和性抗体は10^-12以内であると考えられています。
2. タンパク質 - 小分子	10⁻⁴～10⁻⁵	小分子やタンパク質のKD値は10^-4から10^-5の間であり、10^-3から10^-7が正常値で、10^-10には達しない。共有結合性の小分子は10^-10に達する可能性がある。
3. アビジン-ビオチン	10^-14	アフィニティーは非特異的な結合を起こしやすいため、ストレプトアビジンまたは脱グリコシル化アフィニティーを使用することができる。
4. DNA-タンパク質	10^-8～10^-10	高品質で完全なDNAであること。電気泳動の影響を避けるよう注意すること。

親和性判定のためのサンプル要件

サンプル	要件
1. 高分子サンプル	タンパク質 > 50 µg、抗体 > 100 µg、ビオチン化タンパク質 > 200 µg、ビオチンを含まないタンパク質 > 2 mg、純度要件 > 90%、緩衝液：PBS、HEPBS。イミダゾール基を含まないこと。品質管理が必要。
2. 小分子サンプル	量1mg以上、粉末または液体。液体は水またはDMSOに溶解する必要があります。グリセロール、イミダゾール、トレハロース、その他の塩類を含まないようにしてください。緩衝液中のトリスなどのアミノ基を含む試薬は避けてください。一般的には、有機試薬を含まないPBS、HEPPSなどを使用してください。

アフィニティ測定プラットフォームの利点

複数サンプル分析

Alpha Lifetechは、抗体、細胞、タンパク質、その他の生体分子など、さまざまなサンプルに対する親和性アッセイを提供できます。

成熟したテクノロジープラットフォーム

当社は、SPR結合アッセイ、BLI結合アッセイ、ELISA結合アッセイなどの先進技術を有しています。

柔軟なプロジェクト選択

お客様は、迅速な親和性測定と精密な親和性測定のいずれかを選択できます。

高精度の結果

当社の専門技術チームは、効率的で正確かつ信頼性の高い親和性判定結果を保証いたします。

事例研究場合

BLI迅速親和性アッセイ抗体およびアプタマー親和性アッセイ

SAプローブ特異性を持つビオチン化アプタマーを捕捉し、溶解する。サンプルを溶解・希釈して一定濃度とし、捕捉したプローブ特異的なターゲット1-5アプタマーを固化させ、シグナル飽和後、サンプルに結合させる。その後、96ウェルプレートに添加する。

図5：96ウェルプレートサンプルの検出位置の分布。Bはセンサーのバランス調整と解離に使用されるバッファーを示します。L：ビオチンターゲット1-5アプタマー、221：サンプル。

データの安定性と精度を確保するためにドリルダウンに注意を払い、結果を得るために適切なプログラムを設定してください。

図6：ターゲット1、2、3アプタマーとサンプル間の相互作用フィッティング図。（CH 1 \ 3 \ 5は、固化されたターゲット1 \ 2 \ 3アプタマープローブとサンプル間の相互作用の信号とデータを表す。）

図7：ターゲット4および5アプタマーとサンプル間の相互作用フィッティング図。（CH1/3は、固化されたターゲット4/5アプタマープローブとサンプル間の相互作用のシグナルとデータを表す。）

結果によると

以下の結果が得られました。フィッティング後のターゲット 1 アダプターとサンプルとの親和性は 9.41 ^ -8 でした。フィッティング後のターゲット 2 アダプターとサンプルとの親和性は 8.32 ^ -8 でした。フィッティング後のターゲット 3 アダプターとサンプルとの親和性は 8.64 ^ -8 でした。フィッティング後のターゲット 4 アダプターとサンプルとの親和性は 3.70 ^ -8 でした。フィッティング後のターゲット 5 アダプターとサンプルとの親和性は 3.01 ^ -8 でした。

ご不明な点がございましたら、いつでもお気軽にお問い合わせください。

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