アフィニティ測定プラットフォーム
Alpha Lifetech は、Octet および Biacore-T2000 プラットフォームに基づいて、信頼性の高い親和性判定サービスを提供できます。
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アフィニティ測定プラットフォーム
Alpha Lifetechは、OctetおよびBiacore-T2000プラットフォームを基盤として、信頼性の高い親和性測定サービスを提供しています。抗体、細胞、タンパク質、低分子化合物など、多様なサンプルの親和性測定が可能です。表面プラズモン共鳴（SPR）法やバイオレイヤー干渉（BLI）法など、様々な親和性測定法をご用意しています。
Alpha Lifetechは、ELISAと親和性測定を組み合わせた専門的かつ高精度な親和性測定プラットフォームを有し、世界中のお客様に専門的、効率的、迅速、かつ高精度な親和性測定結果を提供しています。お客様には、迅速親和性測定と精密親和性測定の2つの方法からお選びいただけます。迅速親和性測定は単一濃度の測定であり、精密親和性測定は異なる濃度の親和性を測定できます。様々な低分子化合物、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴマー、脂質、バクテリオファージ、ウイルス、細胞間の相互作用の研究に適用できます。この親和性測定プラットフォームは、親和性薬物試験・スクリーニング、抗体発見の基盤を築き、その後の研究を促進します。
結合親和性の紹介
親和性は、分子間相互作用、親和性薬物アッセイ、および薬物スクリーニングの評価において重要です。分子間相互作用は、L + R = LR という式で表すことができます。ここで、L は遊離リガンド、R は結合していない受容体、LR は結合したリガンド受容体複合体を表します。結合反応は分子間相互作用を定義し、反応中に平衡に達するまで結合状態と非結合状態の間で動的な交換が起こります。これは、反応の 2 つの速度定数、Kon (結合速度定数) と Koff (解離速度定数) で表すことができます。結合定数 (Ka) の逆数である Kd 値は、Koff/Kon であり、反応親和性にとって重要な定数です。したがって、2 つの分子間の結合が強いほど、親和性は高くなります。Kd 値が小さいほど、その逆になります。この式は、片対数グラフ上のS字曲線として表すことができます。x軸（対数軸）にリガンド濃度、y軸に分数境界をとります。破線は、Kd値（1 nM）が0.5の結合分率におけるリガンド濃度を表します。
図1：細胞表面受容体に結合したリガンドの濃度変化に伴うシグモイド結合曲線。（出典： Hunter SA、Cochran JR. タンパク質間相互作用の親和性を決定するための細胞結合アッセイ：技術と考慮事項。）
親和性を決定する方法
ELISA結合親和性アッセイ
抗体親和性の研究に広く用いられている技術は、ELISA法に基づいています。ELISA法は、簡便性、迅速性、簡便性、高感度、そして高い特異性といった特徴を備えています。少量の試薬（抗体と抗原）を用いて、精製試薬を必要とせずに抗体親和性を測定できます。抗原を固体表面に固定化し、一次抗体を用いて検出することで、標識された二次抗体が一次抗体と反応し、酵素結合免疫吸着測定（ELISA）リーダーでデータを読み取り、分析します。
図2: 設計されたペプチドの標的への結合を評価するためのELISAに似たアッセイ。(出典: Hajikarimlou, Maryam, et al., 2022. SARS-CoV-2表面タンパク質Sを検出するペプチドを迅速に設計するための計算的アプローチ。）
表面プラズモン共鳴（SPR）結合親和性アッセイ
SPR技術は主に屈折率の変化を検出します。従来の光学現象と光の共鳴現象を利用することで、バイオセンシングチップ上のリガンドと分析対象物質の相互作用を検出するバイオセンシング分析技術を構築できます。生物学的反応中のSPR角度の動的変化をモニタリングすることで、バイオ分子間の結合および相互作用の特異的なシグナルを得ることができます。
図3: H10/AGR2結合の表面プラズモン共鳴（SPR）解析。（出典： Garri, Carolina, et al., 2018. 前方勾配ホモログ2 (AGR2)に対する新しいペプチドの同定、特性評価および応用。）
バイオレイヤー干渉（BLI）結合親和性アッセイ
バイオフィルム干渉技術は、ラベルフリーのリアルタイムモニタリング光検出技術であり、主に分子間相互作用の網羅的定量分析やタンパク質濃度測定に用いられます。この技術は、プローブ型バイオセンサーを用いて、サンプル上のバイオフィルムの厚さの変化を直接検出します。干渉スペクトルの変位変化を検出することで、センサー表面で相互作用するバイオ分子間の結合と解離を検出し、干渉スペクトルのリアルタイム変位（nm）を表示します。
図4：aLDRGとキチンオリゴ糖間のバイオレイヤー干渉法（BLI）アッセイ。（出典： Li, Bing, 2023. 真菌共生に関与するArmillaria sp. 541の根粒菌と菌糸の比較トランスクリプトームの特徴、特にLysMドメインに着目。）
BLIとSPR技術の比較
| テクノロジー名 | BLI（バイオレイヤー干渉法） | SPR（表面プラズモン共鳴） |
|---|---|---|
| 原理 | センサー表面における反射光の干渉パターンの変化を測定し、バイオレイヤーにおける光学的厚さの変化を介して分子間相互作用を検出します。リアルタイムの結合曲線（直接測定）を提供します。 | センサーチップ表面近傍の屈折率の変化（光が金とガラスの界面に相互作用し、屈折率の変化を引き起こす）を検出することで分子間相互作用を測定します。データは共鳴角の変化として反映されます（間接測定）。 |
| メーカー | サルトリウス | GE |
| 楽器 | ForteBioバイオセンサー | オープンSPR機器 |
| システム | ForteBio Octet システム（分子相互作用解析用） | TraceDrawer（スウェーデンのRidgeview Instruments社が開発） |
| 利点 | 1. 幅広いサンプル適合性と優れた安定性を備え、特に低分子の検出に適しています（サンプルの純度や緩衝液条件に関する具体的な要件はそれほど厳しくありません）。SSAチップは結合研究において費用対効果に優れています。 2. SPR に比べてスループットが速く、実験時間が短くなります。 | 1. BLI に比べて開発の歴史が長く、感度が高くなります。 2. 高い親和性と特異性データを使用して希少または貴重なタンパク質を検出するなど、特定のアプリケーションに対する精度と堅牢性が向上します。 |
| デメリット | 1. SPR に比べてデータの精度がわずかに低くなります。 2. 機器の慎重なメンテナンスが必要です。 3. SSA チップのコストは比較的高いです。 | 1. 非常に小さな分子を検出するための緩衝液条件は厳しい場合があり、検出が失敗するリスクが高まります。 2. チップは一般的に、BLI で使用されるチップよりも高価です。 3. 長時間の実験中にサンプルが蒸発すると問題が発生する可能性があります。 |
| チップタイプ | SSAチップ | NTAチップ |
親和性測定の範囲
親和性測定には、抗原-抗体（強い抗原-抗体、弱い抗原-抗体）、タンパク質-タンパク質、タンパク質-ペプチド、タンパク質-小分子、タンパク質DNA/RNA（アプタマー）が含まれます。KDを測定する際には、いずれかのモル濃度を知る必要があります。小分子が結合する場合、1つの分子量は150ダルトン未満にはなりません。
| タイプ | 範囲 | 予防 |
|---|---|---|
| 1. 抗原-抗体 | 10^-6から10^-12 | ほとんどの抗体のKd値は10^-6～10^-7から10^-9の範囲です。一般的に、高親和性抗体は10^-9以内、高親和性抗体は10^-12以内であると考えられています。 |
| 2. タンパク質 - 小さな分子 | 10^-4から10^-5 | 小分子およびタンパク質の KD は 10^-4 から 10^-5 の間ですが、10^-3 および 10^-7 が正常であり、10^-10 に達することはできません。 共有結合した小分子は 10^-10 に達することがあります。 |
| 3. アビジン-ビオチン | 10^-14 | アフィニティは非特異的結合を容易に起こすことができ、ストレプトアビジンまたは脱グリコシル化アフィニティを使用できます。 |
| 4. DNA-タンパク質 | 10^-8から10^-10 | 高品質で完全な DNA。電気泳動の影響を防ぐように注意してください。 |
親和性測定のためのサンプル要件
| サンプル | 要件 |
|---|---|
| 1. 巨大分子サンプル | タンパク質 > 50 µg、抗体 > 100 µg、ビオチン化タンパク質 > 200 µg、ビオチンを含まないタンパク質 > 2 mg、純度要件 > 90%、緩衝液：PBS、HEPBS。イミダゾール基は含有できません。品質管理が必要です。 |
| 2. 小分子サンプル | 1mgを超える量、粉末または液体。液体は水またはDMSOに溶解する必要があります。グリセロール、イミダゾール、トレハロースなどの塩を含まないようにしてください。緩衝液（通常はPBS、HEPPSなど）には、トリスなどのアミノ基を含む試薬は使用しないでください。有機試薬は使用しないでください。 |
複数サンプルの分析
Alpha Lifetech は、抗体、細胞、タンパク質、その他の生体分子を含むさまざまなサンプルの親和性アッセイを提供できます。
成熟した技術プラットフォーム
当社は、SPR 結合アッセイ、BLI 結合アッセイ、ELISA 結合アッセイなどの高度なテクノロジーを備えています。
柔軟なプロジェクト選択
お客様は、迅速な親和性判定と正確な親和性判定のいずれかを選択できます。
高精度な結果
当社の専門技術チームは、効率的、正確、かつ信頼性の高い親和性判定結果を保証できます。
ケーススタディ場合
BLI迅速親和性アッセイ抗体およびアプタマー親和性アッセイ
SAプローブ特異性を持つビオチン化アプタマーを捕捉し、溶解します。サンプルを溶解・希釈して一定濃度にし、プローブ特異的に捕捉されたTarget 1-5アプタマーを固化させ、シグナル飽和後にサンプルに結合させます。その後、96ウェルプレートに添加します。
図5：96ウェルプレートサンプルの検出位置の分布。Bはセンサーのバランス調整と解離に使用されるバッファーを示す。L：ビオチンターゲット1-5アプタマー、221：サンプル。
データの安定性と正確性を確保するために掘削に注意し、結果を得るために適切なプログラムを設定します。
図6：ターゲット1、2、3のアプタマーとサンプル間の相互作用フィッティング図。（CH 1 \ 3 \ 5は、固化したターゲット1 \ 2 \ 3アプタマープローブとサンプル間の相互作用の信号とデータを表します。）
図7：ターゲット4および5のアプタマーとサンプル間の相互作用フィッティング図。（CH 1 \ 3は、固化したターゲット4 \ 5のアプタマープローブとサンプル間の相互作用の信号とデータを表します。）
結果は
以下の結果が得られました: ターゲット 1 アダプターのフィッティング後のサンプルに対する親和性は 9.41 ^ -8、ターゲット 2 アダプターのフィッティング後のサンプルに対する親和性は 8.32 ^ -8、ターゲット 3 アダプターのフィッティング後のサンプルに対する親和性は 8.64 ^ -8、ターゲット 4 アダプターのフィッティング後のサンプルに対する親和性は 3.70 ^ -8、ターゲット 5 アダプターのフィッティング後のサンプルに対する親和性は 3.01 ^ -8 です。
ご不明な点がございましたら、いつでもお気軽にお問い合わせください。
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2018年7月16日 
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