動物予防接種プラットフォーム
アルファライフテックの動物源は明確で、検査検疫許可証、明確な遺伝的背景、明確な免疫頻度、詳細な免疫間隔記録などを有しており、抗体生産に便利なサービスを提供しています。主にラクダ科動物(アルパカ、リアマ、ラクダ)を免疫し、ナノボディ生産の基盤を築いています。また、お客様の免疫頻度や免疫原性要件に応じて、ニュージーランドシロウサギ、マウスなどの一般動物を免疫し、PBMC(末梢血単核球)を抽出・分離し、後続の実験(モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体開発など)に使用することができます。お客様はご自身で免疫原をご提供いただくことができ、当社は厳格な品質管理を実施します。ウイルス性免疫原をご提供いただく場合は、不活化処理が必要であり、当社は不活化試験を実施し、安全性を確保します。同時に、お客様のニーズに合わせて対応する免疫原をカスタマイズすることも可能です。
動物の免疫化入門
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ナノボディなどの動物由来抗体を作製する際、まず動物を免疫し、対応するB細胞、抗体、またはPBMC(末梢血単核細胞)を得ることが最初のステップです。これにより、さらなる抗体産生の準備、基礎科学研究の促進、臨床診断ツールの開発、そして新薬の発見・開発の促進につながります。ラクダ、アルパカ、リアマなどのラクダ科動物は、免疫採血とPBMCの抽出により、ナノボディ(単一ドメイン抗体)ライブラリーを作製できます。ウサギなどの動物は免疫し、体から抗体を抽出します。精製後、ポリクローナル抗体の作製に利用できます。マウスやラットなどは、免疫抽出したB細胞と骨髄腫細胞を融合させることで、モノクローナル抗体を作製できます。免疫付与を行う前に、3R原則(代替、削減、精製)を遵守する必要があります。これにより、使用する動物数を必要最小限にまで大幅に削減し、実験手順を改善し、動物の苦痛を最小限に抑えることができます。適切な実験設計、適切な抗体の選択、厳格な検証手順にも従う必要があります。
免疫原の分類 - ナノボディの生産
| 免疫原の種類 | 例 | 免疫原の調製 | 注記 |
|---|---|---|---|
| タンパク質免疫原 | 酵素、タンパク質、細菌毒素、その他の物質 | さまざまなタンパク質発現システムを選択: 大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞、無細胞システム | タンパク質発現に影響を与える温度、時間、pH、封入体などの要因に注意してください |
| 核酸免疫原 | DNA、RNA | DNA免疫原:プラスミドDNAを構築し、標的遺伝子に適した発現ベクターをクローン化し、細胞を培養してプラスミドDNAを増幅し、高純度のプラスミドDNAを抽出します。 RNA免疫原:分解を防ぐためにハット構造とポリAテールを追加する必要性 | DNA 免疫原を調製する場合は適切な宿主細胞に注意する必要があり、RNA 免疫原を調製する場合は RNA の分解を防ぐことに注意する必要があります。 |
| ウイルス免疫原 | 全ウイルス不活化ワクチン、サブユニットワクチン、ウイルスベクターワクチン(アデノウイルス、レンチウイルスなど)、mRANワクチン。 | ウイルス全体を不活化ワクチンとして調製する場合、安全性を高めるためにまずウイルスを不活化します。不活化が完全に行われたかどうかを確認するために毒性試験が行われます。サブユニットワクチンは、抗原としてウイルス表面タンパク質のみを必要とするため、免疫効果を考慮する必要があります。 | 免疫効果を得るためにはアジュバントを添加する必要があり、不活化する必要のあるウイルスには注意を払う必要があり、免疫効果を確保するためには適切なウイルス力価が必要であり、調製プロセスの安全性は厳密に管理される必要があります。 |
動物の予防接種のプロセスまたはタイムライン
動物の選択と抗原の調製
動物の選定:健康なグループから適切な年齢と健康な体格のアルパカを選定し、血液検査や病気の検査を行って感染症やその他の健康上の問題がないことを確認します。
免疫原の調製: 免疫原は免疫反応を誘導するための鍵であり、標的抗体の要件に基づいて適切なタンパク質、ペプチド、またはその他の適切な物質を選択する必要があります。
アルパカは1~3種類の抗原を同時に免疫することができます。1回の免疫あたりの抗原総量は1~2mg、免疫液量は2mL未満です。免疫前に、抗原とアジュバントを1:1の比率で乳化させて均一な混合物とし、4℃で保存します。
免疫学的アルパカ
ブランクのアルパカの耳番号を記録し、免疫実験を開始します。アルパカの首近くの両側リンパ節に、それぞれ2点ずつ、約0.4mLの乳化抗原を注入します。免疫後、30分間観察し、アルパカに不快感がないことを確認してください。免疫は2週間ごとに、少なくとも4回実施してください。
採血
5〜7日間の4回の免疫付与後、アルパカの首の静脈から50mlの血液を採取します。
血清分離
各抗原免疫の前に、免疫評価のために血液サンプルを採取し、毎回5mLを採取しました。同日、血液は25℃に予冷した遠心分離機を用いて400×gで30分間遠心分離しました。上層の血清を分離し、その後の抗体価検査のために保存しました。
リンパ球を分離する
まず細胞分離液15mLを加え、次に血液15mLを50mL遠心管にゆっくり加えます。血液を加える際は、血液と分離液が混ざらないように注意してゆっくりと加えます。25℃で予冷した遠心分離機で、400×gで30分間遠心分離し、上層の血清を新しい遠心管に入れて-80℃で保存します。ピペットを使用して、中間の綿状の上層免疫細胞を新しい50ml遠心管に吸引します。各チューブに室温のPBS緩衝液10mLを加え、25℃、400×gで20分間遠心分離します。上清を取り除き、各チューブに室温のPBS緩衝液5mLを加え、軽く混ぜ、血球計算板で細胞数を算出し、25℃、400×gで20分間遠心分離します。上清を除去し、RNAiso Plusで得られたリンパ球を細胞数に応じて溶解し、10^7/mLの細胞溶解液を得て、-80℃で保存します。

図1:さまざまな抗体発見戦略とそれに伴う実験段階の概略図。(図の出典: Laustsen、Andreas H. 他)
顧客は免疫原を提供する - 厳格な品質管理
| 免疫原の種類 | 要件 | 品質管理方法 |
|---|---|---|
| ペプチド/小分子サンプル | 溶解条件(主にファージを不活化するかどうかによる)、分子構造/ペプチド配列、合成レポート(HPLC/MS/HNMR) | HPLC/MS検出 |
| タンパク質サンプル | SDS-PAGE/WB、再構成条件、緩衝液、ラベル情報、総量(20~50μg)、濃度、純度など | SDS-PAGE/WB |
| 細胞サンプル | 細胞の種類(一次細胞/遺伝子編集細胞)、細胞形態(新鮮/凍結解凍)、増殖タイプ(接着/懸濁)、培養培地の要件、提供される細胞数、提供される細胞数、スクリーニングターゲット(顧客対応一次抗体)の安定した発現を保証するための遺伝子編集細胞、回収率を決定するための凍結解凍細胞 | 主に遺伝子編集された細胞をターゲットとし、お客様から提供された一次抗体を使用してELISAでターゲット発現を同定し(弊社はHRP二次抗体を提供)、フローサイトメトリー検出を行います(弊社は蛍光二次抗体を提供できます)。 |


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動物免疫の応用は何ですか?
+ポリクローナル抗体は動物の免疫化によって生産することができ、モノクローナル抗体はB細胞と骨髄腫細胞を融合することによって生産することができ、PBMCはラクダ源(アルパカ、ラクダ、アルパカなど)から抽出して、ナノボディ、Fabフラグメント、scFv抗体フラグメントなどのさまざまな抗体フラグメント形式を生産することができます。 -
動物の免疫に関する注意事項は何ですか?
+ラクダ由来動物に対するナノ抗体を作製するには、5~6回の免疫接種が必要です。免疫接種前には対照として血液サンプルを採取し、各免疫接種の間隔は2週間とします。4回目の免疫接種後、陽性血液と非免疫接種の陰性血液を採取し、ELISA法で抗体価を測定します。抗体価が10^6未満の場合は、適切なレベルに達するまで免疫接種回数を増やす必要があります。ウサギ免疫(ウサギ免疫の最適または一般的なタンパク質抗原レベルは50〜1000ug)、マウス免疫(マウス免疫の最適または一般的なタンパク質抗原レベルは5〜50ugであり、細胞の場合は10 ^ 6細胞、核酸または炭水化物の場合は10〜50ugが必要です)、ヤギ免疫(ヤギ免疫の最適または一般的なタンパク質抗原レベルは250〜5000ug)など、他の動物免疫の場合、免疫原の投与量、安全性、および有効性に注意を払う必要があります。 -
免疫のある動物を選ぶには?
+お客様が必要とする抗体の種類に応じて、ナノボディやその他の抗体フラグメントを生産する必要がある場合は、ラクダ由来の動物(ラクダ、アルパカ、アルパカ)を免疫に選択できます。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を生産する必要がある場合は、血清の量、抗原、および抗原源に基づいて対応する種を選択する必要があります。ウサギの最大血清量は500mlで、抗原量が少なく、ポリクローナル抗体の生産に最適です。マウスの最大血清量は2ml、ラットの最大血清量は20mlで、通常、モノクローナル抗体の最適な選択肢です。ヤギが産生する抗体は親和性が高く、Alpha Lifetechはお客様の要件に応じて独自の免疫計画をカスタマイズできます。 -
抗原はアジュバントと併用する必要がありますか?どのように選択すればよいですか?
+アジュバントには油性アジュバントと水性アジュバントの2種類があります。可溶性抗原に対する強力な抗体反応を誘導するには、アジュバントの適切な使用が不可欠です。アジュバントの徐放性により、抗原投与量を減らすことができ、抗体反応がより長く持続します。初回注射はアジュバントと併用する必要があります。免疫原の量が少ない場合は、一般的にフロイントアジュバントの使用が推奨されます。 -
アルパカの予防接種の注意点は?
+(1)アルパカと免疫抗原の選択は、免疫化の成功の鍵となります。バランスのとれたラクダを選択することは推奨されません。免疫抗原の純度と正確な構造は、アルパカによる免疫化後の適切な抗体を選別する上で非常に重要です。タンパク質抗原の純度は、通常90%以上です。(2)リンパ球の分離:適時に細胞を分離することで、採血後の溶血を効果的に防ぎ、最良の分離効果を達成することができます。(3)免疫サイクルは免疫反応に影響を与える可能性があります。1〜2週間の免疫間隔により、アルパカはほとんどの抗原に対して良好な免疫反応を示すことができます。

独自に開発されたアジュバント
当社の独自配合のアジュバントはアルパカの免疫システムに合わせて最適化されており、従来のアジュバントよりも高い効力と特異性を備えています。

予防接種の提供標準
当社は指定された時間内に予防接種を完了し、高力価血清を提供し、詳細なレポートを通じて各ステップを記録することをお約束します。

プロジェクト品質管理
各プロジェクトは厳格な品質管理プロセスを経て、高い基準を満たす抗体を顧客に提供します。

明らかにアルパカ背景
私たちは、さまざまな予防接種プログラムをサポートする健康なアルパカの群れを飼育しています。
ご不明な点がございましたら、いつでもお気軽にお問い合わせください。
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2018年7月16日 

