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動物免疫プラットフォーム

動物免疫プラットフォームは主にラクダ科動物(アルパカ、リアマ、ラクダ)を免疫することで、ナノボディ生産の基盤を築いている。

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動物免疫プラットフォーム

Alpha Lifetechの動物由来原料は、検査・検疫許可証、明確な遺伝的背景、明確な免疫頻度、詳細な免疫間隔記録を備えており、抗体生産に便利なサービスを提供しています。主にラクダ科動物(アルパカ、リアマ、ラクダ)を免疫し、ナノボディ生産の基盤を築いています。さらに、お客様のご要望に応じた免疫頻度と免疫原性要件に基づき、一般的な動物(ニュージーランドホワイトウサギ、マウスなど)を免疫し、PBMCを抽出・分離して、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体開発などの後続実験に利用することも可能です。お客様ご自身で免疫原をご提供いただくことも可能で、その場合は厳格な品質管理を行います。ウイルス性免疫原をご提供いただく場合は、不活化処理が必要となり、安全性を確保するために不活化試験を実施いたします。同時に、お客様のご要望に応じて、対応する免疫原をカスタマイズすることも可能です。

動物免疫入門

モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ナノボディなどの動物由来抗体を製造する際、最初のステップは動物を免疫し、対応するB細胞、抗体、またはPBMCを取得して、その後の抗体製造の準備、基礎科学研究の促進、臨床診断ツールの開発、新薬の発見と開発の促進を行うことです。ラクダ、アルパカ、リアマなどのラクダ科の動物は、免疫血液の採取とPBMCの抽出によってナノボディ(単一ドメイン抗体)ライブラリーを製造できます。ウサギなどの動物は免疫して体から抗体を抽出できます。精製後、ポリクローナル抗体の製造に使用できます。マウス、ラットなどは、免疫抽出したB細胞と骨髄腫細胞を融合させることでモノクローナル抗体の製造に使用できます。免疫前には、3R原則(代替、削減、改良)に注意を払う必要があります。これにより、使用する動物の数を必要最小限にまで大幅に削減し、実験手順を改善し、動物の苦痛を最小限に抑えることができます。適切な実験計画、適切な抗体の選択、および厳格な検証手順も遵守しなければならない。

免疫原の分類 - ナノボディの生産

免疫原の種類 免疫原製剤 注記
タンパク質免疫原 酵素、タンパク質、細菌毒素、その他の物質 さまざまなタンパク質発現システムを選択してください:大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞、および無細胞系 タンパク質発現に影響を与える温度、時間、pH、封入体などの要因に注意してください。
核酸免疫原 DNA、RNA
DNA免疫原:プラスミドDNAを構築し、標的遺伝子に適した発現ベクターをクローニングし、細胞を培養してプラスミドDNAを増幅し、高純度のプラスミドDNAを抽出する。
RNA免疫原:分解を防ぐためにハット構造とポリAテールを追加する必要がある
DNA免疫原を調製する際には、適切な宿主細胞に注意を払い、RNA免疫原を調製する際には、RNAの分解を防ぐことに注意を払う必要がある。
ウイルス性免疫原 全ウイルス不活化ワクチン、サブユニットワクチン、ウイルスベクターワクチン(アデノウイルス、レンチウイルスなど)、mRANワクチン。 全ウイルス不活化ワクチンを製造する場合、安全性を高めるためにまずウイルスを不活化する。不活化が完全に行われたかどうかを確認するために毒性試験が行われる。サブユニットワクチンは抗原としてウイルスの表面タンパク質のみを必要とし、免疫効果を考慮する必要がある。 免疫効果を得るためにはアジュバントを添加する必要があり、不活化すべきウイルスに注意を払い、免疫効果を確保するためには適切なウイルス力価が必要であり、製造工程の安全性を厳密に管理する必要がある。

動物の予防接種プロセスまたはタイムライン

動物の選択と抗原の調製

動物の選定:健康な群れの中から、適切な年齢と健康な体格のアルパカを選び、血液検査と疾病スクリーニングを実施して、感染症やその他の健康上の問題がないことを確認する。
免疫原の調製:免疫原は免疫応答を誘導する鍵であり、標的抗体の要件に基づいて適切なタンパク質、ペプチド、またはその他の適切な物質を選択する必要があります。
アルパカには1~3種類の抗原を同時に投与することができ、1回の免疫投与あたりの抗原総量は1~2mg、投与量は2mL未満である。免疫投与前に、抗原とアジュバントを1:1の比率で乳化して均一な混合物を作り、4℃で保存する。

免疫学的なアルパカ

アルパカの耳の番号を記録し、免疫実験を開始します。アルパカの首の近くのリンパ節に、左右それぞれ2箇所ずつ、各箇所に約0.4mLの乳化抗原を注射します。免疫後、30分間観察し、アルパカに不快感がないことを確認します。免疫は2週間ごとに、少なくとも4回実施する必要があります。

採血

5~7日間で4回の予防接種を行った後、アルパカの首の静脈から50mlの血液を採取する。

血清分離

免疫評価のため、各抗原接種前に血液サンプルを採取し、毎回5mLの血液を採取した。採取した血液は、同日に25℃に予冷した遠心分離機を用いて400×gで30分間遠心分離した。上層の血清を分離し、後日抗体価検査のために保存した。

リンパ球を分離する

まず、15mLの細胞分離溶液を加え、次に15mLの血液を50mL遠心分離管にゆっくりと加えます。血液と分離溶液が混ざらないように、血液を加えるときは注意深くゆっくりと行ってください。25℃に予冷した遠心分離機で400xgで30分間遠心分離し、上澄みの血清を新しい遠心分離管に入れて-80℃で保存します。ピペットを使用して、中綿状の上層免疫細胞を新しい50mL遠心分離管に吸引します。各チューブに室温の10mLのPBS緩衝液を加え、25℃で400xgで20分間遠心分離します。上清を取り除き、各チューブに室温の5mLのPBS緩衝液を加え、穏やかによく混ぜ、血球計算盤を使用して細胞数を計算し、25℃で400xgで20分間遠心分離します。上清を除去し、RNAiso Plusで得られたリンパ球を細胞数に基づいて溶解し、10^7/mLの細胞溶解液を得て、-80℃で保存する。
抗体発見
図1:さまざまな抗体発見戦略とそれに伴う実験段階の模式図。(図の出典: Laustsen, Andreas H. 他

顧客は免疫原を提供する - 厳格な品質管理

免疫原の種類 要件 品質管理方法
ペプチド/低分子サンプル 溶解条件(主にファージを不活化できるかどうかによる)、分子構造/ペプチド配列、合成レポート(HPLC/MS/HNMR) HPLC/MS検出
タンパク質サンプル SDS-PAGE/WB、再構成条件、緩衝液、ラベル情報、総量(20~50μg)、濃度、純度など SDS-PAGE/WB
細胞サンプル 細胞の種類(初代細胞/遺伝子編集細胞)、細胞形態(新鮮/凍結融解)、増殖タイプ(接着性/浮遊性)、培養培地の要件、提供される細胞数、スクリーニング対象物の安定発現を保証するための遺伝子編集細胞(顧客対応の一次抗体)、回収率を決定するための凍結融解細胞 主に遺伝子編集細胞を対象とし、顧客から提供された一次抗体を用いてELISA法で標的発現を同定し(当社はHRP標識二次抗体を提供)、フローサイトメトリーで検出します(当社は蛍光標識二次抗体を提供できます)。

1ページ目よくある質問2よくある質問3
  • 動物免疫の応用例にはどのようなものがありますか?

    +
    ポリクローナル抗体は動物の免疫によって産生でき、モノクローナル抗体はB細胞と骨髄腫細胞を融合させることによって産生でき、PBMCはラクダ由来(アルパカ、ラクダ、アルパカなど)から抽出して、ナノボディ、Fabフラグメント、scFv抗体フラグメントなどの様々な抗体フラグメント形態を産生することができる。
  • 動物の免疫に関する予防措置は何ですか?

    +
    ラクダ由来動物用のナノ抗体を産生するには、5~6回の免疫接種が必要です。免疫接種前に、対照として血液サンプルを採取し、各免疫接種の間隔を2週間とします。4回目の免疫接種後、ELISA法を用いて抗体価を測定するため、陽性血液と非免疫陰性血液を採取します。抗体価が10⁶未満の場合は、抗体価が適切なレベルに達するまで免疫接種回数を増やします。ウサギの免疫(ウサギの免疫に最適な、または一般的なタンパク質抗原レベルは50~1000μg)、マウスの免疫(マウスの免疫に最適な、または一般的なタンパク質抗原レベルは5~50μgで、細胞の場合は10^6個の細胞が必要であり、核酸または炭水化物の場合は10~50μg)、ヤギの免疫(ヤギの免疫に最適な、または一般的なタンパク質抗原レベルは250~5000μg)などの他の動物の免疫については、免疫原の投与量、安全性、および有効性に注意を払う必要があります。
  • 免疫力のある動物を選ぶにはどうすれば良いですか?

    +
    お客様が必要とする抗体の種類に応じて、ナノボディやその他の抗体断片を生産する必要がある場合は、ラクダ由来の動物(ラクダ、アルパカ、ヤギ)を免疫に用いることができます。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を生産する必要がある場合は、血清量、抗原量、抗原源に基づいて適切な動物種を選択する必要があります。ウサギの最大血清量は500mlで、少量の抗原で済むため、ポリクローナル抗体の生産に最適です。マウスの最大血清量は2ml、ラットの最大血清量は20mlで、通常はモノクローナル抗体の生産に最適です。ヤギ由来の抗体は高い親和性を持ち、Alpha Lifetechはお客様のご要望に応じて独自の免疫プランをカスタマイズできます。
  • 抗原はアジュバントと併用する必要があるのか​​?また、どのように選択すればよいのか?

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    アジュバントには、油性タイプと水性タイプの2種類があります。可溶性抗原に対する強力な抗体反応を誘導するには、アジュバントを適切に使用することが不可欠です。アジュバントは持続放出型であるため、抗原の投与量を減らすことができ、抗体反応の持続期間も長くなります。初回注射はアジュバントと併用する必要があります。免疫原の量が少ない場合は、一般的にフロイントアジュバントの使用が推奨されます。
  • アルパカの予防接種に関する注意事項は?

    +
    (1)アルパカの選択と免疫抗原の選択は、免疫を成功させる鍵となります。体格の良いラクダを選ぶことは推奨されません。免疫抗原の純度と正しい構造は、アルパカによる免疫後の後続の用途に適した抗体を選別する上で非常に重要です。タンパク質抗原の純度は一般的に90%以上です。
    (2)リンパ球の分離:タイムリーな細胞分離は、採血後の溶血を効果的に防止し、最良の分離効果を実現します。
    (3)免疫サイクルは免疫反応に影響を与える可能性がある。1~2週間の免疫間隔があれば、アルパカはほとんどの抗原に対して良好な免疫反応を示すことができる。
利点1

独自に開発された補助剤

当社独自の配合アジュバントは、アルパカの免疫系に合わせて最適化されており、従来のアジュバントよりも高い効力と特異性を提供します。
利点2

予防接種の実施
標準

私たちは、指定された期間内に予防接種を完了し、高力価の血清を提供し、各段階を詳細な報告書で記録することを約束します。
利点3

プロジェクトの品質管理

各プロジェクトは厳格な品質管理プロセスを経て、顧客に高い基準を満たす抗体をお届けすることを保証しています。
利点4

明らかにアルパカ背景

私たちは健康なアルパカの群れを擁しており、それが様々な予防接種プログラムを支えています。
ご不明な点がございましたら、いつでもお気軽にお問い合わせください。

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