01
アプタマー研究サービス
アプタマーの紹介
アプタマーは、ランダムに配列が割り当てられた合成オリゴヌクレオチドのライブラリから、複数回の反復選択を伴うSELEXスクリーニングと呼ばれるプロセスによってin vitroでスクリーニングされる一本鎖核酸（DNAやRNAなど）分子です。Alpha Lifetechが所有するアプタマー開発サービスの主な内容は、アプタマーライブラリの構築、アプタマーSELEXスクリーニング、アプタマーSELEXシーケンシング、アプタマー配列解析、およびその他のアプタマー解析です。
SELEXシーケンシングは、アプタマーSELEXスクリーニングとハイスループットシーケンシングを組み合わせたものです。アプタマーSELEXシーケンシングにより、標的に結合したアプタマーの特異的配列を効率的に決定することができ、その後のアプタマー配列解析および応用のための基礎データが得られます。
アプタマーは、科学研究、疾患治療、バイオセンサー構築、医薬品の発見、環境モニタリングなど、幅広い分野で利用されています。しかしながら、in vitroでスクリーニングされたオリゴヌクレオチドアプタマーは、in vivoで容易に分解され、毒性を示すことさえあります。そのため、スクリーニングされたアプタマーを最適化した後、アプタマー開発の成功を評価するためにin vitro解析が必要となります。お客様の様々な分析ニーズに合わせて、Alpha Lifetechは多様なアプタマー解析戦略をご用意しています。
図1 アプタマー解析の図。出典：Thevendran R, Citartan M. 2022. アプタマーの結合親和性を推定するアッセイ。
アプタマー研究サービスの紹介
アプタマー安定性解析
ヌクレアーゼ分解実験
アプタマーを様々なヌクレアーゼ（DNase、RNaseなど）と特定の条件下でインキュベートすることで、アプタマーの分解を観察し、その抗分解能を評価することができます。これは、実用化におけるアプタマーの安定性と耐久性を評価するのに役立ちます。
蛍光標識法
アプタマーの安定性は、アプタマー上の蛍光体を標識し、標的への結合前後の蛍光シグナルの変化を観察することによって間接的に評価されます。例えば、アプタマーが標的に結合すると、その構造が変化し、蛍光シグナルが増強または減少することがあります。
熱安定性分析
アプタマーの熱安定性は、異なる温度における融点（Tm値）の変化を測定することで評価されます。アプタマーの融点が高いほど、熱安定性は良好です。
動的安定性解析
表面プラズモン共鳴（SPR）などの技術を使用して、アプタマーとターゲット間の結合および分離プロセスをリアルタイムで監視し、動的パラメータ（結合速度定数、解離速度定数など）を取得し、アプタマーとターゲット間の相互作用メカニズムをさらに理解し、その動的安定性を評価しました。
構造安定性解析
X 線結晶構造解析、核磁気共鳴 (NMR) およびその他の構造生物学技術を使用して、アプタマーの 3 次元構造とその構造安定性を分析しました。
アプタマー特異的分析
アプタマー結合アッセイ
親和性は、アプタマー結合アッセイを実施し、アプタマーと標的分子間の結合定数（解離定数Kdなど）を測定することで評価されます。Kd値が低いほど、親和性が高いことを示します。アプタマー結合アッセイは、高い結合能を持つ医薬品候補を選別し、その後の薬力学および薬物動態試験に使用することができます。
逆スクリーニング実験
リバーススクリーニングアッセイは、多数の候補分子から非標的分子を迅速に除外するスクリーニング法です。リバーススクリーニングは、この特性または機能を持たない分子を除外するように設計されています。リバーススクリーニングの鍵は、スクリーニングプロセス中に非標的分子を識別および除去できるように、適切なリバーススクリーニングマーカーまたは条件を選択することです。この実験では、非標的分子の選択が非常に重要です。選択された非標的分子は、アプタマースクリーニングを妨害する可能性のある物質を代表するものであり、可能性のある妨害因子が可能な限り網羅されていることを確認する必要があります。
競合阻害実験
アプタマーと標的分子の結合系に過剰な競合分子（標的分子と類似構造を持つ分子など）を添加することで、アプタマーと標的分子の結合能力の変化を観察できます。アプタマーの標的分子への結合能力が著しく低下した場合、アプタマーの高い特異性を示します。
場合によっては、競合阻害実験は逆スクリーニング実験の一部として、または逆スクリーニング実験の補助として用いられます。例えば、医薬品スクリーニングプロセスでは、医薬品分子の標的タンパク質への結合能力を競合阻害実験で評価し、その後、逆スクリーニング実験を用いて、正常細胞や組織に強く結合しすぎる化合物を除去することができます。
アプタマー細胞毒性分析
アプタマー細胞毒性分析にはさまざまな実験方法があり、アプタマーが細胞の生存、増殖、または機能に及ぼす影響を評価するために設計されています。
| 方法 | 詳細な紹介 | アドバンテージ | デメリット |
|---|---|---|---|
| MTT検出法 | MTTアッセイは、生細胞のミトコンドリアにおける酵素活性に基づく方法です。生細胞のミトコンドリアに存在するコハク酸脱水素酵素は、外因性MTTを水不溶性の青紫色の結晶であるフォルマザンに還元し、細胞内に沈着させます。一方、死細胞にはこのような作用はありません。この結晶をジメチルスルホキシド（DMSO）で溶解し、酵素分子計で特定の波長（例えば490nmや570nm）の吸光度を検出することで、生細胞数を間接的に反映し、アプタマーの細胞毒性を評価することができます。 | 高感度、経済性、利便性 | 作業負荷が高く、有機溶媒が細胞に損傷を与える可能性があります。最終的な実験結果のみが得られ、細胞毒性の完全なプロセスを見ることはできません。 |
| CCK-8検出法 | Cell Counting Kit-8（CCK-8）は、高感度で非放射性比色検出法です。CCK-8にはWST-8が含まれており、これは生細胞のミトコンドリア内の脱水素酵素によって還元され、水溶性の高いオレンジ色のメチルザン色素を生成します。生成されるメチルザン色素の量は生細胞数と直線関係にあり、450nmの波長におけるメチルザン色素の吸光度を測定することで、生細胞数を間接的に反映し、アプタマーの細胞毒性を評価することができます。 | 操作が簡単、細胞を洗浄する必要がない、検出が迅速、直線検出範囲が広い、感度が高い、再現性に優れている、細胞毒性がほとんどない | 試薬価格が高い。吸光度の減少が生細胞数の減少によるものか、細胞脱水素酵素自体の活性低下によるものか判断が難しい場合がある。 |
| LDH検出法 | LDH（乳酸脱水素酵素）は細胞の細胞質内で安定に存在する酵素であり、細胞膜が損傷すると細胞外に放出されます。LDHは乳酸を触媒してピルビン酸を形成し、INT（テトラゾリウム塩）と反応して紫色の結晶性物質を形成します。特定の波長（例えば490nm）における吸光度を測定することで、細胞損傷の程度を反映し、アプタマーの細胞毒性を評価することができます。 | 細胞の死亡率を直接反映し、細胞へのダメージが少なく、放射性同位元素による汚染もありません。 | 細胞をインキュベーターから頻繁に取り出す必要があり、操作がより複雑になります。最終的な実験結果のみが得られ、細胞毒性の完全なプロセスを見ることはできません。 |
| リアルタイム生細胞イメージング解析 | リアルタイム生細胞イメージングアナライザーを用いて、装置をインキュベータ内に設置し、細胞増殖サイクルの全過程をリアルタイムで観察・記録しました。細胞の形態変化と増殖曲線を解析することで、アプタマーの細胞毒性を評価することができます。この方法により、細胞増殖環境を安定に保ちながら、細胞毒性プロセスのビデオ画像と定量的な結果を得ることができます。 | 細胞毒性プロセスをリアルタイムで監視し、非破壊画像化により細胞への干渉と損傷を軽減します。ビデオと定量化された結果の両方を利用して詳細な分析を行うことができます。 | 設備コストが高く、専門的な操作スキルとデータ分析能力が必要である |
KACHI
アプタマー研究サービスの利点
総合的品質管理
より高い安定性を備えた最適化されたアプタマー
経済的で効率的。より競争力のある価格、より良いサービス
包括的な研究サイトと多様な研究方法
専門的な販売前コンサルティングと販売後サポートサービス
アプタマー分析における豊富な経験
ハイレベルの研究開発チーム
カスタマイズされたアプタマー関連サービス
ご不明な点がございましたら、いつでもお気軽にお問い合わせください。
Leave Your Message
2018年7月16日 
0102