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アプタマー研究サービス
アプタマー入門
アプタマーは、DNAやRNAなどの一本鎖核酸分子であり、SELEXスクリーニングと呼ばれるプロセスによって、ランダムに配列が割り当てられた合成オリゴヌクレオチドのライブラリーから試験管内でスクリーニングされます。SELEXスクリーニングは、複数回の反復選択を含むプロセスです。Alpha Lifetechが提供するアプタマー開発サービスの主な構成要素には、アプタマーライブラリーの構築、アプタマーSELEXスクリーニング、アプタマーSELEXシーケンス、アプタマー配列解析、およびその他のアプタマー解析が含まれます。
SELEXシーケンス法は、アプタマーSELEXスクリーニングとハイスループットシーケンスを組み合わせた手法です。アプタマーSELEXシーケンス法を用いることで、標的に結合したアプタマーの特異的な配列を効率的に決定することができ、その後のアプタマー配列解析および応用のための基礎データが得られます。
アプタマーは、科学研究、疾患治療、バイオセンサー構築、医薬品開発、環境モニタリングなど、幅広い分野で活用されています。しかし、試験管内でスクリーニングされたオリゴヌクレオチドアプタマーは、生体内では容易に分解され、毒性を示す場合もあります。そのため、スクリーニングされたアプタマーを最適化した後、アプタマー開発の成功を評価するために、試験管内分析が必要となります。Alpha Lifetechは、お客様の多様な分析ニーズに合わせて、様々なアプタマー分析戦略をご用意しています。
図1 アプタマー解析の図。参考文献：Thevendran R、Citartan M. 2022. アプタマーの結合親和性を推定するためのアッセイ。
アプタマー研究サービスの紹介
アプタマー安定性分析
ヌクレアーゼ分解実験
アプタマーを様々な種類のヌクレアーゼ（DNase、RNaseなど）と特定の条件下でインキュベートすることにより、アプタマーの分解を観察し、その抗分解能力を評価する。これは、実用化におけるアプタマーの安定性と耐久性を判断する上で有益である。
蛍光標識法
アプタマーの安定性は、アプタマー上の蛍光色素を標識し、標的との結合前後の蛍光シグナルの変化を観察することによって間接的に評価される。例えば、アプタマーが標的に結合すると、その立体構造が変化し、蛍光シグナルが増強または減少する可能性がある。
熱安定性分析
アプタマーの熱安定性は、異なる温度における融解温度（Tm値）の変化を測定することによって評価される。アプタマーの融解温度が高いほど、熱安定性が高いことを示す。
動的安定性解析
表面プラズモン共鳴（SPR）などの技術を用いて、アプタマーと標的分子間の結合および解離過程をリアルタイムでモニタリングし、動的パラメータ（結合速度定数、解離速度定数など）を取得し、アプタマーと標的分子間の相互作用メカニズムをさらに理解し、その動的安定性を評価した。
構造安定性解析
X線結晶構造解析、核磁気共鳴（NMR）などの構造生物学的手法を用いて、アプタマーの三次元構造とその構造安定性を分析した。
アプタマー特異的分析
アプタマー結合アッセイ
親和性は、アプタマーと標的分子間の結合定数（解離定数Kdなど）を測定するアプタマー結合アッセイによって評価されます。Kd値が低いほど親和性が高いことを示します。アプタマー結合アッセイは、高い結合能を持つ医薬品候補を選別し、その後、薬力学および薬物動態学的研究を実施するために利用できます。
逆スクリーニング実験
リバーススクリーニングアッセイは、多数の候補分子から非標的分子を迅速に除外するためのスクリーニング手法です。リバーススクリーニングは、この特性や機能を持たない分子を除外するように設計されています。リバーススクリーニングの鍵は、スクリーニングプロセス中に非標的分子を識別して除去できる適切なリバーススクリーニングマーカーまたは条件を選択することです。この実験では、非標的分子の選択が非常に重要です。選択された非標的分子が、アプタマースクリーニングを妨害する可能性のある物質を代表するものであり、考えられる妨害因子を可能な限り網羅していることを確認する必要があります。
競合阻害実験
アプタマーと標的分子の結合系に、標的分子と類似した構造を持つ分子などの競合物質を過剰に加えることで、アプタマーと標的分子の結合能の変化を観察する。アプタマーの標的分子への結合能が著しく低下した場合、そのアプタマーは高い特異性を持つことを示す。
場合によっては、競合阻害実験を逆スクリーニング実験の一部として、あるいは補助的に使用することができます。例えば、医薬品スクリーニングの過程では、競合阻害実験によって医薬品分子が標的タンパク質に結合する能力を評価し、その後、逆スクリーニング実験を用いて、正常細胞や組織に強く結合しすぎる化合物を除去することができます。
アプタマーの細胞毒性分析
アプタマーの細胞毒性分析には様々な実験方法があり、これらはアプタマーが細胞の生存、増殖、または機能に及ぼす影響を評価するために設計されている。
| 方法 | 詳細な紹介 | アドバンテージ | デメリット |
|---|---|---|---|
| MTT検出方法 | MTTアッセイは、生細胞のミトコンドリアにおける酵素活性を利用した測定法です。生細胞のミトコンドリアに存在するコハク酸デヒドロゲナーゼは、外因性のMTTを水不溶性の青紫色の結晶であるホルマザンに還元し、細胞内に沈着させます。一方、死細胞にはこのような機能はありません。これらの結晶をジメチルスルホキシド（DMSO）で溶解し、酵素計で特定の波長（例えば490nmまたは570nm）における吸光度を測定することで、生細胞数を間接的に反映させ、アプタマーの細胞毒性を評価することができます。 | 高感度、経済性、利便性 | 作業負荷が重く、有機溶媒は細胞に損傷を与える可能性がある。最終的な実験結果しか得られず、細胞毒性の全過程を観察することはできない。 |
| CCK-8検出方法 | Cell Counting Kit-8（CCK-8）は、高感度で非放射性の比色検出法です。CCK-8にはWST-8が含まれており、生細胞のミトコンドリア内の脱水素酵素によって還元され、水溶性の高いオレンジ色のメチルメザン色素が生成されます。生成されるメザン色素の量は生細胞数と直線的に相関しており、450nmの波長におけるメザン色素の吸光度を測定することで生細胞数を間接的に推定し、アプタマーの細胞毒性を評価することができます。 | 操作が簡単で、細胞洗浄の必要がなく、迅速な検出が可能で、広い直線検出範囲、高感度、良好な再現性、低細胞毒性です。 | 試薬価格が高い。吸光度の低下が、生細胞数の減少によるものなのか、細胞脱水素酵素自体の活性低下によるものなのかを判断するのが難しい場合がある。 |
| LDH検出方法 | LDH（乳酸脱水素酵素）は細胞質内に安定に存在する酵素であり、細胞膜が損傷すると細胞外に放出されます。LDHは乳酸を触媒してピルビン酸を生成し、INT（テトラゾリウム塩）と反応して紫色の結晶性物質を形成します。特定の波長（例えば490nm）における吸光度を測定することで、細胞損傷の程度を反映させることができ、それによってアプタマーの細胞毒性を評価することができます。 | これは細胞の死滅率を直接反映し、細胞への損傷が少なく、放射性同位体による汚染もありません。 | 細胞を頻繁にインキュベーターから取り出す必要があり、操作がより複雑になる。最終的な実験結果しか得られず、細胞毒性の全過程を観察することはできない。 |
| リアルタイム生細胞イメージング解析 | リアルタイム生細胞イメージングアナライザーを用いて、装置をインキュベーター内に設置し、細胞増殖サイクルの全過程をリアルタイムで観察・記録した。アプタマーの細胞毒性は、細胞の形態変化と増殖曲線を分析することで評価できる。この方法により、細胞増殖環境を安定させながら、細胞毒性プロセスの動画と定量的な結果を得ることができる。 | 細胞毒性プロセスをリアルタイムで監視でき、非破壊的な画像化により、細胞への干渉や損傷を軽減します。詳細な分析のために、ビデオと定量化された結果の両方が利用可能です。 | 機器のコストが高く、専門的な操作スキルとデータ分析能力が求められる。 |
KACHI
アプタマー研究サービスの利点
総合品質管理
安定性が向上した最適化アプタマー
経済的で効率的。より競争力のある価格、より良いサービス。
包括的な調査拠点と多様な調査方法
専門的な販売前コンサルティングおよび販売後サポートサービス
アプタマー解析における豊富な経験
高レベルの研究開発チーム
カスタマイズされたアプタマー関連サービス
ご不明な点がございましたら、いつでもお気軽にお問い合わせください。
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