ニュース|相補性決定領域のクラスター化がCAR-T細胞の機能不全を引き起こす可能性
2025年1月9日
0102030405060708
2023年8月13日にNature Communications誌に発表された研究で、研究者チームは、単鎖可変断片(scFv)の相補性決定領域(CDR)ループがCARの凝集を引き起こし、キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の機能不全、細胞死、標的抗原発現に対する腫瘍細胞の反応性低下を引き起こし、抗原非依存性活性化および潜在的な機能障害につながる可能性があることを明らかにしました。
背景と方法論背景
CAR-T細胞療法は血液がんの治療に非常に効果的であり、この細胞療法においてCARの設計はさらに重要です。本研究では、ヒトインターロイキン-13受容体α2(IL13Rα2)の細胞外ドメインを、multiBac発現システムを用いてBirAビオチンリガーゼと共発現させました。受容体タンパク質の一連の最適化発現の後、精製およびタンパク質検証を実施しました。ヒトscFv合成ライブラリーをファージディスプレイスクリーニングに使用し、固相スクリーニングおよび結合アッセイ分析により、対応するscFv抗体を選択し、産生させました。SPRおよびELISAアッセイにより、レンチウイルスベクターの構築とパッケージングに適した抗体を選択しました。研究者らはさらにT細胞を導入して培養し、共焦点顕微鏡を用いてこれらの細胞内のCARを観察しました。分布は上部にあります。 CAR-T細胞の挙動を解析するため、研究者らはCAR-T細胞と組換えIL13Rα2の結合を評価し、T細胞表面マーカーを染色し、細胞表面および細胞内部におけるCARの発現を解析した。さらに、CAR-T細胞の増殖とサイトカイン分泌についても検討し、異なるCAR-T構成における遺伝子発現を解析し、それらの差異を強調した。in vivo実験では、マウスに腫瘍細胞をin situで移植し、CAR-T療法を実施した後、in vivoイメージングシステム(IVIS)を用いて腫瘍の増殖をモニタリングした。GraphPad Prismと標準的な有意差マーカーを用いて統計解析を行った。
結論結論
本研究では、CARコンストラクトの構造、細胞外scFv、リンカー、および追加ドメインを評価し、それらがCAR-T細胞のパフォーマンスに与える影響を解明しました。scFv内のCDRループは抗原認識を担っており、scFv内の特定のフレームワークはCARシグナル伝達を意図せず活性化し、T細胞機能を阻害する可能性があることが判明しました。CDRループ内の相互作用は、CARの安定性にさらに影響を及ぼす可能性があります。CDRループの小さな違いがCAR-T細胞の有効性を大きく変える可能性があり、CARの挙動を迅速にスクリーニングする新しい方法が提案されています。
詳細なコンテンツ紹介
CAR-Tの紹介
CAR T細胞療法(キメラ抗原受容体T細胞療法)の鍵は、T細胞の免疫反応を調整し、T細胞を改変し、CAR遺伝子を挿入し、それらをキメラ抗原受容体CARタンパク質としてT細胞の表面に発現させることです。CARはがん細胞表面の抗原を直接認識できるため、患者自身の体内のがん細胞を識別して殺すための特異的な治療法が実現します。2017年以来、FDAはリンパ腫などの血液がんの治療に6つのCAR-T細胞療法を承認しています。しかし、固形腫瘍の治療には依然として困難が伴います。周囲のメディエーターがCARによる腫瘍表面の抗原の認識を妨げる可能性があるためです。さらに、固形腫瘍は不均一性があり、体内の同じがん種でも違いがあるため、治療効果を得るのが困難です。

図1:FDA承認のCAR-T療法。図出典:CAR-T細胞。
はじめにscFv抗体
scFv は、重鎖 (VH) と軽鎖 (VL) が短い柔軟なペプチドで結合した小さな抗体断片で、サイズは約 25 kDa であり、最も一般的に使用されているタイプの組み換え抗体です。scFv はサイズが小さく、特異性が高く、原核生物発現システムで大規模に生産でき、完全な抗原結合部位を備えているため、疾患の診断と治療に広く使用されています。

図2: scFv抗体
CDR入門
相補性決定領域(CDR)は、抗体の可変領域のペプチド断片であり、CDR(抗原結合部位とも呼ばれる)を介して抗原に結合することができます。抗体分子には2つの抗原受容体が含まれ、1つの抗原受容体には6つのCDRが含まれます。CDRは、抗体に対する抗原の結合活性を反映します。
関連する技術
昆虫発現システム
バキュロウイルス昆虫細胞発現システムは、組換えタンパク質の日常的な生産において最も広く利用されているシステムの一つとなっています。バキュロウイルス昆虫細胞システムは、Gタンパク質共役受容体(GPCR)の発現、VLPの産生、そして感染性性腺随伴ウイルス(AAV)2型ベクターの産生に成功しています。この技術の応用例として、HPV VLPをベースとしたワクチンの開発が挙げられます。臨床試験では、桿体ウイルスに感染した昆虫細胞で産生されたHPV 16/18 L1構造タンパク質からなるVLPが、HPV-16およびHPV-18による子宮頸部感染症、ならびに関連する細胞異常や病変を効果的に予防できることが示されています。

図3:製造プロセス。図の出典:昆虫細胞および哺乳類細胞におけるタンパク質発現のための多用途ベクターとしてのバキュロウイルス。
ファージディスプレイ技術
ファージディスプレイ技術は、1985年にGeorge Smithが糸状バクテリオファージの表面に外来ペプチドを提示できることを報告したことから誕生しました。外来DNAをファージのゲノムに挿入することで、融合タンパク質がファージの表面に提示されます。この方法は、ペプチド、タンパク質、抗体を大量に生産するための効果的な方法となり、最大10^10の異なる変異体を含むライブラリの構築を可能にしました。また、ペプチドライブラリの親和性スクリーニングによるタンパク質リガンド相互作用、抗原と抗体の結合部位の研究、scFv抗体、Fab抗体、ナノボディの作製にも利用されています。

図4: ファージディスプレイ技術
ヒトscFv抗体合成ライブラリ
合成抗体ライブラリ(デノボライブラリとも呼ばれる)は、DNA合成やファージディスプレイなどの技術を用いて、天然抗体ライブラリに依存せずに、フレームワーク領域やCDRを含む完全な抗体可変領域を設計・合成する合成法です。化学的または酵素的手法を用いて、フレームワーク領域やCDRを含む抗体配列をコードする合成DNAを合成します。合成されたDNA断片は、PCRなどの技術を用いて抗体発現ベクターに組み立てられ、その後、細菌、酵母、哺乳類細胞などの発現系に導入され、抗体が産生されます。ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ技術などのハイスループットスクリーニング法を用いて、抗体ライブラリから目的の特性を持つ抗体をスクリーニングすることができます。合成抗体ライブラリには、(1)ライブラリのランダム性が向上し、ライブラリの容量が大きい、(2)動物を免疫することなくスクリーニングできる、(3)ナイーブ抗体ライブラリと比較して、合成抗体ライブラリの設計が多様である、といった利点があります。
SPR親和性測定
表面プラズモン共鳴(SPR)は、リガンドと分析対象物質間の結合親和性および速度論パラメータの分析に使用できます。SPR測定は、センサー表面近傍の屈折率変化に基づいており、分析対象物質はセンサー表面に沿って連続的に流れ、測定されます。SPRは、抗体と標的抗原の親和性など、タンパク質間相互作用の相対的な親和性を決定するために使用されます。SPRは、分子吸着の検出、SPR免疫アッセイ、材料特性評価、データ分析、バイオセンサーなどに応用できます。

図5:表面プラズモン共鳴(SPR)。図の出典:Sabban, Sari (2011) Equus caballus IgE とその高親和性 FcεRI 受容体の相互作用を研究するための in vitro モデル システムの開発 (博士論文)、シェフィールド大学、CC BY-SA 3.0
レンチウイルスの構築と生産
レンチウイルスベクターは、高いパッケージング能力、幅広いトレンド、独自の汎用性と安定性を備えており、理想的な遺伝子送達システムです。レンチウイルスは、エイズなどの疾患を引き起こす可能性のあるウイルスの一種です。宿主細胞のゲノムにDNAを挿入することで感染します。レンチウイルスベクターは、一本鎖RNAゲノムと逆転写酵素を備えたレトロウイルスであり、生物体内に遺伝子を挿入・改変することができます。

図6 レンチウイルスであるHIVの構造。図の出典:ウィキペディア
参照参照
[1] Sarén, T.、Saronio, G.、Marti Torrell, P. 他相補性決定領域のクラスター化は CAR-T 細胞の機能不全を引き起こす可能性があります。 Nat Commun 14、4732(2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-40303-z
[2] Kost, T., Condreay, J. & Jarvis, D. 昆虫細胞および哺乳類細胞におけるタンパク質発現のための多用途ベクターとしてのバキュロウイルス Nat Biotechnol 23, 567–575 (2005). https://doi.org/10.1038/nbt1095.
[3] Sparks RP, Jenkins JL, Fratti R. 表面プラズモン共鳴(SPR)を用いた核融合機構における重要コンポーネント間の結合親和性と運動パラメータの決定. Methods Mol Biol. 2019;1860:199-210. doi: 10.1007/978-1-4939-8760-3_12. PMID: 30317506; PMCID: PMC8489108.
[4] https://en.wikipedia.org/wiki/Lentivirus。
[5] https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/research/car-t-cells。