ファージディスプレイライブラリースクリーニングサービス

Alpha Lifetechは長年にわたりファージディスプレイ技術に深く関わってきました。科学研究やプロジェクト研究の時間を節約し、その後の製造を容易にする、完璧な安定性を備えたファージディスプレイ技術プラットフォームを構築しました。また、vhh抗体、scFv抗体、Fab抗体の製造といったサービスも提供しています。

Alpha Lifetechは、抗体ライブラリーの構築と製造を確実に行うための包括的なM13/T7ファージディスプレイプラットフォームを備えています。また、抗体scFvの作製やハイスループット抗体スクリーニングなど、お客様のニーズに合わせたカスタマイズサービスも提供可能です。

ファージディスプレイライブラリ構築プロセス

ファージライブラリ構築のプロセスは以下のとおりです。PCR増幅用の特異的プライマーを設計し、得られた産物をT7/M13ファージベクターと酵素ライゲーションし、組換えファージプラスミドを構築します。組換えファージプラスミドをTG1受容体細胞に形質転換し、適切な抗生物質を含む培地に塗布します。形質転換体を選抜した後、増殖培養を行います。複数回の培養後、ファージは細菌内で複製回数を繰り返すことで、標的タンパク質またはポリペプチドを発現します。その後、ファージライブラリを精製し、不純物や未結合ファージを除去します。

ファージディスプレイライブラリースクリーニング法

ファージディスプレイ抗体生産の成功は、主に抗体ファージディスプレイライブラリに依存しており、ファージパニングの一般的な方法は固相スクリーニングと液相スクリーニングです。固相抗原スクリーニングでは、3〜4回の溶出を通じて特定の抗体を濃縮し、抗体ファージディスプレイライブラリを取得します。液相抗原スクリーニングは、ビオチン標識ターゲットと抗体ファージディスプレイライブラリをインキュベートし、磁気ビーズを使用して結合したファージを捕捉することによって行われます。固相スクリーニングではより多くの抗原が消費され、一部の抗原エピトープが破壊されます。液相スクリーニングは、高効率と濃縮を特徴としていますが、得られる抗体の特異性が低くなります。ファージパニングの方法は実験のニーズに依存し、それらはすべてファージディスプレイ抗体生産の効果に一定の影響を与えます。

ハイスループット抗体スクリーニング

現代医学において、抗体開発は急速に発展しています。様々な抗体開発手法が存在しますが、医学分野ではハイスループット抗体スクリーニングが最も多く用いられています。このプロセスにより、多様な抗体レパートリーを得ることができます。従来の抗体ライブラリースクリーニング法と組み合わせることで、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニング品質を向上させることができます。生物学的スクリーニング後、抗体はロースループットELISAまたはハイスループット抗体スクリーニングによって特性評価されます。

図1 ファージ抗体ライブラリーの構築から抗原に対する親和性が高く免疫原性が低いモノクローナル抗体の生成までの一連の流れを示したフローチャート。（参考元：抗体医薬品発見のための強力なプラットフォームとしてのファージディスプレイ技術 - PMC（nih.gov）

抗体ファージディスプレイスクリーニングの注意事項予防

バッファに関する考慮事項

バッファーの選択においては、標的の安定性、結合微小環境、そして実際のアプリケーションシナリオにおける非特異的結合の最小化を考慮する必要があります。無関係なタンパク質、非イオン性界面活性剤、そして生理的塩濃度は、バックグラウンドの低減に効果的です。また、標的によってはバッファーに二価カチオンやその他の補因子を添加する必要がある場合があります。タンパク質補因子は標的と共固定化することも、ソーティングバッファーに添加することも、さらには標的を捕捉する手段として使用することも可能です。

圧力に関する考慮事項

選択圧に関する一般的な考慮事項には、標的分子の濃度、結合時間、洗浄強度などがあります。選択圧を高めるためのその他の手法には、変性剤（酸、尿素、グアニジンなど）の使用、有機溶媒の使用、温度の上昇、洗浄バッファー内の競合するリガンドまたは標的の濃度の上昇などがあります。
中でも、第1ラウンドのスクリーニングは重要です。第1ラウンドのスクリーニングでは、構築したライブラリから非特異的なクローンを除去しながら、できるだけ多くの陽性クローンを捕捉します。ライブラリの多様性を維持するために、多孔性コーティングされたターゲットや多数の可溶性ターゲットを使用することで、結合したファージを多数捕捉できるようにする必要があります。その後のスクリーニングでは、濃縮度の増加、複数回の洗浄、洗浄時間の延長などにより選択圧を高めることで、親和性の高いクローンをスクリーニングできます。

ネガティブスクリーニング戦略

抗原タグおよびキャリア材料のスクリーニングプロセスでは、タグ、融合タンパク質、支持基質など、抗原コンジュゲート上のすべての物質をスクリーニングします。非標的物質のネガティブスクリーニングは、標的抗原以外の抗体の濃縮を制限する可能性があります。
トランスフェクト細胞株をスクリーニングする場合、模擬トランスフェクト細胞または非トランスフェクト細胞を使用して、全細胞、リポソーム、ナノリン脂質ディスク、および VLP をネガティブスクリーニングできます。
複雑な抗原混合物の除去全細胞や不純なタンパク質などの未知または複雑な標的分子に対して、厳密なネガティブスクリーニングを実行できます。
抗原の特定部位に対する抗体の戦略としては、高濃度のリガンドを添加してリガンドと競合できる抗体を溶出させることと、抗体をブロックすることです。

ファージディスプレイの応用

*現代医学において、抗体の発見はますます重要になっています。抗体発見には様々なアプローチがありますが、医学分野ではファージディスプレイ技術が最も多く利用されています。1990年以降、VH、VHH、scFv、ダイアボディ、Fab抗体など、様々な抗体フォーマットがファージライブラリの構築に利用されてきました。
*ファージペプチドライブラリーは、タンパク質エピトープの配列を迅速に決定することを可能にし、エピトープと抗原受容体との相互作用を調査するための強力なツールとなっている。
*抗体断片をM13ファージのG3Pに融合し、抗体断片をコードする遺伝子を多数クローニングすることで、多様な抗体を選択できる大規模なファージディスプレイ抗体ライブラリを生成することができます。
※T7ファージディスプレイシステムは、簡便性、高い安全性、安定性、保管・輸送の容易さなど多くの利点があり、予防・治療用ワクチンに利用されています。
※T7ファージディスプレイシステムは、病原微生物の表面抗原や癌抗原など、さまざまな抗原を検出することができます。

ファージ