単一B細胞選別プラットフォーム
モノクローナル抗体(mAb)は抗体医薬品のパイオニアとして、100種類以上のモノクローナル抗体が癌、感染症、自社創薬市場などの治療薬として承認されており、独自の治療価値を示しています。新世代の抗体開発技術であるシングルB細胞抗体技術は、単一のB細胞から効率的かつ迅速に抗体を単離することができ、ハイブリドーマやファージディスプレイに続く抗体生産技術の画期的な進歩です。シングルB細胞ソーティング技術は、ウサギ、マウス、ラクダ、ヒツジ、ニワトリなど、複数の種に対する抗体産生に用いることができます。シングルB細胞技術は、高い特異性、高い活性、高い親和性といった優れた利点を有しています。アルファライフテックは、シングルB細胞ソーティングプラットフォームを基盤として、スクリーニング時間と高品質抗体の取得において優位性を有しています。抗原設計、合成、改変、動物免疫、シングルB細胞濃縮スクリーニング、シングルセルシーケンシング、ハイスループットスクリーニング、発現、精製、機能検証などのワンストップ技術サービスを提供し、お客様の多様なニーズにお応えします。
単一B細胞スクリーニング技術の概要
単一B細胞スクリーニング法は、主にランダム分離法と抗原選択分離法に分けられます。ランダム分離法は、抗原選択分離法の濃度が高いサンプルに適用され、B細胞のみを分離します。操作は簡単ですが、多くの労力が必要であり、抗原特異的分離の最初のステップとしてよく使用されます。抗原特異的分離法は、抗腫瘍抗体や自己免疫抗体などの特異的抗体の含有量が少ない状況に適しています。抗原と抗体が特異的に結合する免疫原理を利用して特定のB細胞を分離するのは比較的複雑です。よく使用される分類方法とその長所と短所を表に示します。
| アプローチ | 利点 | デメリット | |
|---|---|---|---|
| ランダム 分離 | マイクロマニピュレーション | 低い装備要件 簡単な操作 | 効率が低い 限られた種類の単離細胞 |
| レーザーキャプチャーマイクロダイセクション | 高い位置精度 簡単な操作 サンプルから類似の細胞を視覚的に選択し、不純物を除去する | 複雑なサンプル準備プロセス 自動化できない | |
| 蛍光活性化細胞選別 | 高い精度と効率 高度な自動化 幅広い用途 | 複雑な操作 高い装備要件 | |
| 抗原選択分離 | 多パラメータ蛍光標識抗原 | 高い精度と効率 高度な自動化 ハイスループットとマルチパラメータ 異なる段階のB細胞を分離する能力 | 複雑な操作 高い装備要件 |
| 抗原コーティング磁性ビーズ | 簡単な操作 高い再現性 標的B細胞を濃縮できる | 複雑な操作 磁気ビーズは細胞の生物学的活性に影響を与え、分離後の培養や操作には役立ちません。 | |
| マイクロエングレービング | 高効率 高速 | 高い装備要件 効率が低い | |
| チップ上の免疫スポットアレイアッセイ | 高度な自動化 高い精度と効率 | 複雑な操作 高コスト |
シングルB細胞スクリーニング抗体サービスプロセス
動物の予防接種
実験動物(マウス、ウサギなど)に適切な抗原を選択して免疫刺激を与え、抗原に対する特異的な抗体を生成できるようにします。
動物免疫は抗体産生の初期段階です。動物免疫は、生物自身の体液性免疫応答機構を利用し、抗原の持続的な刺激を通じて動物が強力な免疫応答を生成し、特定の抗原に対する特異的な抗体を分泌するものです。
B細胞の収集と濃縮
B細胞は免疫動物の末梢血、脾臓、またはリンパ節から単離され、免疫学的に刺激されて特定の抗原に対する抗体を産生します。
物理的または化学的方法(密度勾配遠心分離、磁気ビーズ分離など)により、B 細胞を濃縮し、不純な細胞を除去し、B 細胞の純度とその後の分離の効率を向上させます。

図1 ウサギモノクローナル抗体のクローニングと調製。出典:単一B細胞クローニングとウサギモノクローナル抗体の産生。
B細胞選別
蛍光活性化セルソーティング(FACS)、磁気細胞分離(MACS)、マイクロ流体セルソーター(MCS)、またはその他のハイスループットスクリーニング技術を抗原特異的標識と組み合わせることで、濃縮されたB細胞から個々のB細胞をスクリーニングし、標的抗体を生成することができます。
混合B細胞集団から単一のB細胞を単離する場合、その抗体遺伝子を単一細胞シーケンシング技術を用いて配列決定し、解析することで、重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)のDNA配列情報を取得する必要があります。単一細胞シーケンシング技術は、主に単一細胞単離、細胞内核酸増幅、そしてシーケンシング解析という3つのステップで構成されます。単一細胞シーケンシングの原理は、単離された単一細胞から微量な全ゲノムDNAまたはRNAを増幅し、ハイスループットシーケンシングのための高いカバレッジを持つ完全なゲノムまたはトランスクリプトームを取得することです。
ハイスループットスクリーニングにより、数千個のB細胞の抗体遺伝子配列を一度に取得できるため、抗体発見のスピードが大幅に向上します。これらの配列情報は、抗体ライブラリの構築やスクリーニングにも活用できます。

図2 単一B細胞の捕捉、ライブラリー構築、ハイスループットスクリーニングおよびシーケンシングの概略図。(参考元: 大規模並列単一細胞B細胞受容体配列決定により、多様な抗原反応性抗体の迅速な発見が可能になる。
抗体遺伝子増幅
単一のB細胞を切断してmRNAを放出します。次に、重鎖可変領域(VH)と軽鎖可変領域(VL)のcDNA配列を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって増幅します。
抗体の発現と精製
増幅された可変領域遺伝子を定常領域遺伝子を含むベクタープラスミドに挿入し、モノクローナル抗体発現プラスミドを構築した。その後、適切な発現系(CHO細胞などの真核生物発現系または大腸菌などの原核生物発現系)を選択して発現させ、生物活性を有するモノクローナル抗体を得る。発現した抗体はプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いて細胞培養物から抽出・精製し、高品質な組換えモノクローナル抗体を得た。
抗体の検証
抗体の特異性、親和性、および生物学的活性をELISA、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫沈降法を用いて検証し、抗体の性能が期待通りであることを確認します。抗体検証は、抗体の品質と信頼性を確保するための重要なステップです。
免疫原の要件
(1)組換えタンパク質:2.5 mg以上、タンパク質純度85%以上、タンパク質分子量10 kDa以上、可溶性タンパク質濃度0.5~5 mg/mL。抗原アフィニティー精製が必要な場合は、組換えタンパク質10 mgを追加してください。
(2)ポリペプチドおよび小分子:裸ペプチド≥10mg、ペプチド純度>90%、10AA以上、KLH / BSA / OVAまたはその他のキャリアタンパク質を結合。小分子は事前に構造評価が必要です。
シングルB細胞ソーティングサービスのワークフロー
| 手順 | サービス内容 | タイムライン |
|---|---|---|
| ステップ1:動物の免疫化とELISA検出 | (1)動物は4〜5回免疫化され、4回目の投与から血清が採取され、ELISAによる抗体価の検出が行われた(タンパク質抗原ELISA血清力価>10^5、ペプチド抗原ELISA血清力価>10^4)。 同時に、0.1mlの免疫前血清と免疫後血清が検査のために顧客に送られます。力価が不合格の場合、免疫は継続されるか、顧客がプロジェクトの終了を要求し、免疫部分のみ請求されます。 (2)力価が適格であれば、全血からPBMC細胞を分離した。 | 10~12週間 |
| ステップ2:単一B細胞選別 | (1)脾臓を採取し、単一B細胞懸濁液を調製し、末梢血を採取しPBMC細胞を分離した。 (2)免疫抗原マーカーFITCおよびAF648。 (3)二重蛍光フローソーティング+単一B細胞クローン培養。 (4)ELISAによる同定+陽性クローンの配列決定。 | 2~3週間 |
| ステップ3:抗体の発現と検証 | (1)6-10配列の遺伝子合成+哺乳類発現試験の検証。 (2)ELISAによる同定 | 3~4週間 |
| ステップ4: 配送 | (1)抗体配列:4~6個の抗体配列(未発現配列は一緒に送達される)。 (2)発現した配列ごとに0.2mgの抗体が送達された。 (3)実験報告 | 1週間 |
ご不明な点がございましたら、いつでもお気軽にお問い合わせください。
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2018年7月16日 

