合成Fabライブラリ構築サービス

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抗体ライブラリは通常、ネイティブ、免疫、または合成ライブラリに分類されます。抗体ライブラリには、ファージディスプレイ抗体ライブラリ、無細胞分子ディスプレイ抗体ライブラリ（リボソームディスプレイ抗体ライブラリ、mRNAディスプレイ抗体ライブラリ、DNAディスプレイ抗体ライブラリ）、細胞表面ディスプレイ抗体ライブラリ（細菌表面ディスプレイ抗体ライブラリ、真菌表面ディスプレイ抗体ライブラリ、酵母表面ディスプレイ抗体ライブラリ、哺乳類細胞表面ディスプレイ抗体ライブラリ）が含まれます。

Fab は完全な抗体フラグメントであり、VH と重鎖定常領域 CH1、軽鎖 VL と軽鎖定常領域 CL で構成され、これらは鎖間ジスルフィド結合によって接続されてヘテロ二量体を形成し、完全な抗原結合部位が 1 つだけあります。その分子量は完全な IgG 分子の約 1/3 であり、高い親和性を持つ理想的な抗体を迅速に選別できます。

図1 ヒトIgGおよびその断片の構造。（参考元：感染症における合成抗体 - PubMed（nih.gov）

抗体ファージディスプレイ

抗体は脊椎動物の免疫システムに不可欠な要素であり、高い親和性と特異性で抗原に特異的に結合することで機能します。技術の発展に伴いハイブリドーマ技術が生まれ、この技術を用いてFAD承認を受けた世界初の治療用抗体が作製されました。

しかし、ハイブリドーマ技術を用いて作製されたモノクローナル抗体には一定の限界があります。治療用抗体としてヒトに投与した場合、強い副作用を引き起こす可能性があります。このため、免疫原性の低いキメラ抗体やヒト化抗体が治療用に作製されています。近年開発されたマウスおよびファージディスプレイ技術により、アミノ酸配列がヒト抗体に類似した完全ヒト抗体を作製することが可能となり、免疫原性が低くなっています。

抗体ファージディスプレイは標的特異的な抗体を産生し、動物免疫に基づく抗体産生法の限界の一部を克服することができます。1990年以降、抗体をディスプレイするファージライブラリの構築には、重ドメインヒト抗体フラグメント（VH）、重ドメインヘラジカおよびサメ抗体フラグメント（VHH）、scFv、糖尿病抗体（二価scFv）、および完全フラグメント抗原結合（Fab）抗体など、様々な抗体フォーマットが使用されてきました。

アルファライフテックが提供できるもの

Alpha Lifetechは長年にわたり抗体ファージディスプレイ技術に深く関わってきました。科学研究やプロジェクト研究の時間を節約し、その後の製造を容易にする、完璧な安定性を備えたファージディスプレイ技術プラットフォームを構築しました。また、Alpha Lifetechは、抗体ファージディスプレイ（ナノボディファージディスプレイ、scFvファージディスプレイ、Fabファージディスプレイ）もお客様に提供しています。

Alpha Lifetechは、抗体ライブラリーの構築と製造を確実に行うための包括的なM13/T7ファージディスプレイプラットフォームを備えています。また、scFvファージディスプレイ、Fab抗体の産生、Fab抗体の精製など、お客様のニーズに合わせたカスタマイズサービスも提供可能です。

合成Fab抗体ライブラリー構築の事例

Huang G は、1 回の電気穿孔で取得できる新しいファージディスプレイ Fab ライブラリ方法を確立し、ライブラリの多様性は 10^9-10^10 です。

実験プロセスには、1) 高効率エレクトロコンピテントセルの準備、2) dU-ssDNA の抽出、3) クンケル法に基づくオリゴヌクレオチド誘導変異誘発、4) エレクトロポレーションおよびライブラリサイズの計算、5) フォールディングおよび機能的多様性の評価のためのタンパク質 A/L ベースの酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA)、6) 多様性 DNA 配列分析が含まれます。

図2 ライブラリーサイズを計算するためのファージ滴定。（出典：多様性をカスタマイズした合成ファージディスプレイFabライブラリーの構築 - PubMed（nih.gov）

Kim YJは、SARS-CoV-2 Sタンパク質のRBD上のFab合成ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングし、SARS-CoV-2を中和できるモノクローナル抗体を取得し、ウイルスの侵入をうまく防ぎ、抗体を治療ツールとして使用するための基礎を提供しました。

図3 固定化されたSARS-2受容体結合ドメイン（RBD）上のファージディスプレイ合成Fabライブラリのパニング。（参考元：ヒト合成Fabファージディスプレイライブラリーから単離された重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2に対する中和ヒト抗体 - PubMed（nih.gov）

合成Fab抗体ライブラリー構築サービス

抗体分子Fabと一本鎖ファージコートタンパク質（PⅢまたはPⅧ）を結合させることで、組換えファージプラスミドの構築に成功しました。これをTG1受容体細胞に形質転換し、適切な抗生物質を含む培地に塗布した後、タンパク質のスクリーニング後に増幅培養を行いました。複数回の培養後、ファージは細菌内で複数回複製され、標的タンパク質またはポリペプチドの発現に成功しました。抗原吸着-溶出-増幅のプロセスを繰り返し、目的のFab抗体をスクリーニングし、Fab抗体を精製しました。

合成Fab抗体ライブラリー構築ワークフロー

手順	仕様
ステップ1：免疫検査とELISA検査	1) 免疫試験動物（標準免疫5回注射） 2) ELISA 血清抗体価検出（それぞれ 4 および 5 の抗体価検出）で、4 回目の投与で抗体価検出が要件を満たしている場合（ELISA 血清抗体価がタンパク質 >10^5、小分子 >10^4 を満たす場合）、採血の 7 日前に再度免疫し、要件を満たしていない場合は定期免疫を継続します（抗体価検査結果と免疫血清を顧客に提出し、抗体価検査結果に基づいて、フォローアップ操作のために陽性血清動物を選択します）。力価が適格であり、血液サンプル採取によりPBMCが分離された。
ステップ2：Fabモノクローナル抗体スクリーニングサービス	1) ライブラリーcDNAを鋳型として、V遺伝子を3輪PCRで増幅した。 2) ファージディスプレイベクターの構築と形質転換：V遺伝子スプライシングファージディスプレイベクター、宿主細菌の電気ショック形質転換、抗体ライブラリーの構築 3) 同定: 24個のクローンをランダムに選択し、PCR法で陽性率を測定した。 4) デフォルトの 3 ラウンドのスクリーニング: 3 ラウンド目の製品の NGS シーケンス。同時に、誘導発現と ELISA 検出のために 192 個のクローンが選択されました。 5) すべての陽性クローンを選択して遺伝子配列を決定しました（スクリーニングごとに60個を超える陽性クローン、最大192個）。 6) 納品: Fab抗体配列5-10（非反復配列）; ラボレポート、生のテストデータ、ファージライブラリ
ステップ3：IgGモノクローナル抗体の組換え発現	1) 顧客の検証結果に応じて、5 つのシーケンスの表現を再編成することを顧客に推奨します。 2) ベクター構築 + 細胞発現 + 精製