酵母表面提示ライブラリースクリーニングサービス

Alpha Lifetechは、酵母ディスプレイライブラリーの構築と抗体ライブラリーのスクリーニングを専門としており、世界中のクライアント向けに、さまざまな形態の酵母ライブラリーを生成し、高親和性かつ特異的な抗体をスクリーニングする能力を提供しています。専門の研究者チーム、高度な技術、設備により、幅広い疾患関連タンパク質を標的とした酵母ライブラリーを構築できます。タンパク質酵母ディスプレイ、低分子酵母ディスプレイ、抗体酵母ディスプレイなど、ファージディスプレイおよび酵母ディスプレイ技術を提供できます。

当社の酵母ディスプレイライブラリーは、大容量かつ高多様性を誇り、特定の抗体配列を効果的にスクリーニングするための強固な基盤を提供します。お客様のご要望に応じて、様々な形態の抗体酵母ディスプレイライブラリー（IgG、scFv、VHH、Fab抗体ライブラリー）、タンパク質ライブラリー、ペプチドライブラリー、cDNAライブラリーなどを構築できます。さらに、免疫ライブラリー、天然ライブラリー、合成ライブラリー、半合成ライブラリー、疾患抗体ライブラリーなど、多様な特性を持つ抗体ライブラリーの開発も可能です。

酵母ディスプレイシステム入門

酵母表面提示技術は、遺伝子融合によって組換えタンパク質を酵母表面に提示する方法である。最も一般的な酵母提示システムは、標的タンパク質をαレクチン接合タンパク質のAga2pサブユニットのC末端に融合させたもので、標的タンパク質の両側にエピトープタグ（N末端9アミノ酸のヘマグルチニン（HA）タグとC末端10アミノ酸のc-mycタグ）が付加されている。69アミノ酸のAga2pサブユニットは、725アミノ酸のαレクチンAga1pサブユニットと2つのジスルフィド結合で結合し、Aga1pはβ1,6-グルカン共有結合によって細胞壁に固定される。そのため、標的タンパク質は酵母細胞表面に提示され、その後、対応するリガンドによって認識される。フローサイトメトリースクリーニングによって、ライブラリーから機能性タンパク質を分離する。

図1：酵母表面表示の原理。（図の出典：酵母表面提示法のタンパク質工学への応用。）

酵母表面ディスプレイライブラリ入門

酵母ディスプレイソーティングは、酵母表面ディスプレイをベースとした手法で、主に細胞表面タンパク質を標的とする抗体ライブラリーのスクリーニングに用いられます。酵母細胞と他の細胞表面との非特異的結合が少ないため、酵母を用いた生物学的選択法は、大規模な結合ライブラリーから希少なクローンを選別することが可能です。

酵母表面提示ライブラリースクリーニングサービス

プラスミドを準備し、酵母細胞を培養し、標的タンパク質をコードするDNAを合成し、誘導性プロモーター、シグナルペプチド、および表面提示タンパク質（Aga2pなど）に融合した標的遺伝子を含む酵母発現ベクターにクローニングします。標的タンパク質をコードする遺伝子は、酵母細胞壁タンパク質（通常はAga2p）をコードする遺伝子と融合させることができ、融合遺伝子はエレクトロポレーションによって酵母細胞に導入できます。形質転換後、表面に抗体遺伝子を発現する酵母細胞は、抗原特異的スクリーニング試験に供されます。酵母ライブラリーを標的抗原とインキュベートし、特異的に結合する酵母細胞を選択します。蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いて、目的の特性を持つタンパク質を発現する酵母細胞を分離することで、最大約10^8～10^9個の酵母細胞からなるライブラリーサイズで酵母ディスプレイライブラリースクリーニングを実施できます。陽性クローンは、さらなる解析や下流アプリケーションのために分離できます。抗体ライブラリーから特定の抗体クローンが同定されると、それらをさらに特性解析し、大量生産し、プロテインA/Gアフィニティークロマトグラフィーなどの技術を用いて精製することで、酵母ディスプレイスクリーニングと抗体生産の全プロセスを完了することができる。

酵母ディスプレイライブラリースクリーニングのプロセス

図2 酵母ディスプレイライブラリースクリーニングプロセス

酵母ディスプレイライブラリースクリーニングサービスのワークフロー

手順	サービスコンテンツ	タイムライン
抗原調製	抗原の種類：顧客が抗原を提供できる場合、種類に応じて対応するサンプルを納品する必要があります。組換えタンパク質は3～3.5mgで純度85%以上、低分子は結合させて純度90%以上、ペプチド合成は結合させて純度90%以上、ウイルスなどのサンプルタイプは不活化、RNAは分解防止のために検査が必要であり、上記の抗原タイプは合成用にカスタマイズすることも可能です。	2～3週間
動物免疫	動物への免疫接種回数は5回であり、血清力価検査に基づいて免疫接種回数を増やすべきかどうかを判断する必要がある。抗原免疫：タンパク質／ウイルス抗原力価＞10⁵；ペプチド／小分子抗原力価＞10⁴	5～6週間
テンプレートcDNAの調製	血漿PBMCを分離し、総RNAを抽出し（RNA抽出キットを使用）、逆転写してcDNAにする。	1日
図書館建設	ライブラリーcDNAを鋳型として、2回のPCRによりVHH遺伝子を増幅し、VHH遺伝子スプライシング酵母ディスプレイベクターを構築した。このベクターをエレクトロポレーションにより酵母細胞に導入し、抗体ライブラリーを構築した。48個のクローンをランダムに選択し、PCR法を用いて陽性率（>90%）を判定した。ライブラリー容量（10^7～10^8）を計算し、NGSシーケンスによりライブラリー挿入率（>90%）とライブラリー多様性を判定した。	2週間
図書館上映会	標準的な3段階のスクリーニング：蛍光標識タンパク質を用いたFACSスクリーニングに続き、第3段階でNGSシーケンス解析を実施。陽性クローンを1グラム誘導発現およびELISA検出のために選択。すべての陽性クローンを遺伝子シーケンス解析のために選択し、異なるCDR領域配列を選定。	2～3週間
抗体検証	抗体配列に適した発現ベクターを構築することで、抗体の発現、抗体の精製、ELISAおよびBLIによる抗体抗原結合の検証による抗体親和性の検証、そしてフローサイトメトリーによる細胞機能の検証が容易になる。	1週間

酵母表面提示ライブラリースクリーニングの事例

構造選択性ナノボディの迅速な発見のための酵母表面提示プラットフォームに関する文献において、著者らは酵母表面提示に基づく完全なin vitroナノボディ発見プラットフォームを確立した。まず、ラクダの遺伝子から合成ナノボディライブラリーを設計した。図Dは、ナノボディのカルボキシル末端にHAタグがあり、その後、ナノボディが酵母細胞壁に共有結合で固定されることを示している。図Eは、ナノボディスクリーニングプロセスを示している。抗原親和性ナノボディを有する酵母を単離、増幅し、FACSによって抗体を繰り返し選択した。著者らはこのプラットフォームを通じて、2つの異なるヒトGPCRを標的とする構造選択性ナノボディを発見した。