酵母表面ディスプレイライブラリースクリーニングサービス

Alpha Lifetechは、酵母ディスプレイライブラリの構築と抗体ライブラリのスクリーニングを専門としており、世界中のお客様に対し、様々な形態の酵母ライブラリを作製し、高親和性で特異性の高い抗体をスクリーニングするサービスを提供しています。専門の研究者チーム、高度な技術と設備を駆使し、幅広い疾患関連タンパク質を標的とした酵母ライブラリを構築できます。タンパク質酵母ディスプレイ、低分子酵母ディスプレイ、抗体酵母ディスプレイなど、ファージディスプレイおよび酵母ディスプレイ技術を提供しています。

当社の酵母ディスプレイライブラリは、大容量かつ高い多様性を誇り、特定の抗体配列を効果的にスクリーニングするための優れた基盤を提供します。お客様のニーズに合わせて、IgG、scFv、VHH、Fab抗体ライブラリなど、様々な形態の抗体酵母ディスプレイライブラリ、タンパク質ライブラリ、ペプチドライブラリ、cDNAライブラリなどを構築可能です。さらに、免疫ライブラリ、天然ライブラリ、合成ライブラリ、半合成ライブラリ、疾患抗体ライブラリなど、様々な特性を持つ抗体ライブラリの開発も可能です。

酵母ディスプレイシステムの紹介

酵母表面ディスプレイ技術は、遺伝子融合によって酵母の表面に組み換えタンパク質をディスプレイする方法です。最も一般的な酵母ディスプレイシステムは、αレクチン接合タンパク質のAga2pサブユニットのC末端に融合した標的タンパク質を使用し、主に標的タンパク質の両側のエピトープタグ、すなわちN末端9アミノ酸のヘマグルチニン（HA）タグとC末端10アミノ酸のc-mycタグで構成されています。69アミノ酸のAga2pサブユニットは、2つのジスルフィド結合を介して725アミノ酸のαレクチンAga1pサブユニットに結合し、Aga1pはβ1,6-グルカン共有結合を介して細胞壁に固定されています。したがって、標的タンパク質は酵母細胞の表面にディスプレイされ、その後、対応するリガンドによって認識されます。フローサイトメトリースクリーニングを通じて、ライブラリから機能性タンパク質を分離します。

図1：酵母表面ディスプレイの原理。（図出典：酵母表面ディスプレイのタンパク質工学への応用。）

酵母表面ディスプレイライブラリーの紹介

酵母ディスプレイソーティングは酵母表面ディスプレイをベースとし、主に細胞表面タンパク質を標的とする抗体ライブラリのスクリーニングに用いられます。酵母細胞と他の細胞表面との間の非特異的結合が低いため、酵母生物学的選択は大規模な結合ライブラリをスクリーニングし、希少クローンを発見することが可能です。

酵母表面ディスプレイライブラリースクリーニングサービス

プラスミドを調製して酵母細胞を培養し、標的タンパク質をコードする DNA を合成して、誘導性プロモーター、シグナルペプチド、および表面ディスプレイタンパク質 (Aga2p など) に融合した標的遺伝子を含む酵母発現ベクターにクローニングします。標的タンパク質をコードする遺伝子は、酵母細胞壁タンパク質 (通常は Aga2p) をコードする遺伝子と融合することができ、融合遺伝子はエレクトロポレーションによって酵母細胞に形質転換することができます。形質転換後、表面に抗体遺伝子を発現している酵母細胞は、抗原特異的スクリーニング試験を受けることができます。酵母ライブラリーを標的抗原とともにインキュベートし、それに特異的に結合する酵母細胞を選択します。蛍光活性化細胞選別 (FACS) を使用して、目的の特性を持つタンパク質をディスプレイしている酵母細胞を単離することにより、最大ライブラリーサイズが約 10 ^ 8 ～ 10 ^ 9 個の酵母細胞で酵母ディスプレイライブラリーのスクリーニングを実行できます。その後、陽性クローンを単離して、さらなる分析や下流のアプリケーションに使用できます。抗体ライブラリから特定の抗体クローンが特定されると、それらはさらに特徴付けられ、大量生産され、タンパク質 A/G アフィニティークロマトグラフィーなどの技術を使用して精製され、酵母ディスプレイスクリーニングと抗体生産の全プロセスを完了することができます。

酵母ディスプレイライブラリースクリーニングのプロセス

図2 酵母ディスプレイライブラリーのスクリーニングプロセス

酵母ディスプレイライブラリースクリーニングサービスのワークフロー

手順	サービス内容	タイムライン
抗原調製	抗原の種類: 顧客が抗原を提供できる場合、種類に応じて対応するサンプルを納品する必要があります。組み換えタンパク質は 3 ～ 3.5 mg 必要で純度要件は 85% 以上、小分子は結合して純度要件は 90% 以上、ペプチド合成は結合して純度要件は 90% 以上、ウイルスなどのサンプルの種類は不活性化する必要があり、RNA は劣化を防ぐために検査する必要があり、上記の抗原の種類は合成用にカスタマイズすることもできます。	2～3週間
動物の免疫	動物の免疫回数は5回であり、血清力価検査の結果に基づいて免疫回数を増やす必要があるかどうかを判断する必要がある。抗原免疫：タンパク質／ウイルス抗原力価＞105；ペプチド／低分子抗原力価＞10^4	5～6週間
テンプレートcDNAの調製	血漿 PBMC を分離し、全 RNA を抽出し (RNA 抽出キット)、cDNA に変換します。	1日
図書館建設	ライブラリcDNAを鋳型として、2回のPCRでVHH遺伝子を増幅し、VHH遺伝子スプライシング酵母ディスプレイベクターを構築した。このベクターをエレクトロポレーション法で酵母細胞に形質転換し、抗体ライブラリを構築した。48個のクローンをランダムに選択し、PCR法を用いて陽性率（>90%）を確認した。ライブラリ容量（10^7-10^8）を計算し、NGSシーケンシングによりライブラリ挿入率（>90%）とライブラリ多様性を測定した。	2週間
図書館上映	デフォルトの3ラウンドのスクリーニング：蛍光標識タンパク質FACSスクリーニング、続いて3ラウンド目のNGSシーケンシング。陽性クローンは、単一グラム誘導発現およびELISA検出のために選択されました。すべての陽性クローンは遺伝子シーケンシングのために選択され、異なるCDR領域配列が選択されました。	2～3週間
抗体検証	抗体配列に適した発現ベクターを構築することで、抗体の発現、抗体の精製、抗体の親和性を検証するための抗体抗原結合のELISAおよびBLI検証、および細胞機能を検証するためのフローサイトメトリー遮断を容易に行うことができます。	1週間

酵母表面ディスプレイライブラリースクリーニングの事例

構造選択的ナノボディの迅速発見のための酵母表面ディスプレイプラットフォームに関する文献において、著者らは酵母表面ディスプレイに基づく完全なin vitroナノボディ発見プラットフォームを確立した。まず、ラクダ遺伝子を出発点として合成ナノボディライブラリを設計した。図Dは、ナノボディのカルボキシル末端にHAタグが付与され、その後、ナノボディが酵母細胞壁に共有結合的に固定される様子を示している。図Eは、ナノボディのスクリーニングプロセスを示している。抗原親和性ナノボディを有する酵母を単離・増幅し、FACSによって抗体を繰り返し選択した。著者らはこのプラットフォームを通じて、2つの異なるヒトGPCRを標的とする構造選択的ナノボディを発見した。