ერთჯერადი B უჯრედების დახარისხების პლატფორმა

B უჯრედების დახარისხების პლატფორმაზე დაფუძნებულ Alpha Lifetech-ს უპირატესობა აქვს სკრინინგის დროისა და მაღალი ხარისხის ანტისხეულების მიღების თვალსაზრისით.

დაგვიკავშირდით

ერთჯერადი B უჯრედების დახარისხების პლატფორმა

მონოკლონური ანტისხეული (mAb), როგორც ანტისხეულების შემცველი პრეპარატების პიონერი, 100-ზე მეტი მონოკლონური ანტისხეული დამტკიცებულია კიბოს, ინფექციური დაავადებების სამკურნალოდ, საკუთარი წამლების შემუშავების ბაზარზე და აჩვენებს მათ უნიკალურ თერაპიულ ღირებულებას. ერთუჯრედიანი B უჯრედის ანტისხეულების ტექნოლოგია, როგორც ანტისხეულების შემუშავების ტექნოლოგიის ახალი თაობა, ეფექტურად და სწრაფად იზოლირებს ანტისხეულებს ერთუჯრედიანი B უჯრედებიდან, რაც წარმოადგენს გარღვევას ანტისხეულების წარმოების ტექნოლოგიაში ჰიბრიდომისა და ფაგის ჩვენების შემდეგ. ერთუჯრედიანი B უჯრედების დახარისხების ტექნოლოგია შეიძლება გამოყენებულ იქნას ანტისხეულების გენერირებისთვის მრავალი სახეობის წინააღმდეგ, როგორიცაა კურდღლები, თაგვები, აქლემები, ცხვრები და ქათმები. ერთუჯრედიან B ტექნოლოგიას აქვს გამორჩეული უპირატესობები, როგორიცაა მაღალი სპეციფიკურობა, მაღალი აქტივობა და მაღალი აფინურობა. ერთუჯრედიანი B უჯრედების დახარისხების პლატფორმაზე დაფუძნებულ Alpha Lifetech-ს აქვს უპირატესობები სკრინინგის დროსა და მაღალი ხარისხის ანტისხეულების მიღებაში. მას შეუძლია უზრუნველყოს ანტიგენის დიზაინი, სინთეზი და მოდიფიკაცია, ცხოველთა იმუნიტეტი, ერთუჯრედიანი B უჯრედების გამდიდრების სკრინინგს, ერთუჯრედიან სეკვენირებას, მაღალი გამტარუნარიანობის სკრინინგს, ექსპრესიას და გაწმენდას, ერთიანი ტექნიკური მომსახურების მიწოდებას, როგორიცაა ფუნქციური ვერიფიკაცია, მომხმარებელთა მრავალფეროვანი საჭიროებების დასაკმაყოფილებლად.

B-უჯრედების ცალკეული სკრინინგის ტექნიკის შეჯამება

B უჯრედების სკრინინგის მეთოდები ძირითადად იყოფა შემთხვევითი იზოლაციის მეთოდად და ანტიგენსელექციურ იზოლაციად. შემთხვევითი გამოყოფა გამოიყენება ანტიგენსელექციური იზოლაციის მაღალი კონცენტრაციის მქონე ნიმუშებზე და მხოლოდ B უჯრედები გამოიყოფა. მისი გამოყენება მარტივია, მაგრამ დიდ შრომას მოითხოვს და ხშირად გამოიყენება ანტიგენ-სპეციფიკური გამოყოფის პირველ ეტაპად. ანტიგენ-სპეციფიკური გამოყოფის მეთოდი შესაფერისია იმ სიტუაციებისთვის, როდესაც სპეციფიკური ანტისხეულების, როგორიცაა სიმსივნის საწინააღმდეგო ანტისხეულები და აუტოიმუნური ანტისხეულები, შემცველობა დაბალია. შედარებით რთულია სპეციფიკური B უჯრედების იზოლირება ანტიგენისა და ანტისხეულების ორიგინალთან სპეციფიკური შეკავშირების იმუნოლოგიური პრინციპის გამოყენებით. კლასიფიკაციის ხშირად გამოყენებული მეთოდი და მისი უპირატესობები და ნაკლოვანებები მოცემულია ცხრილში.

	მიდგომები	უპირატესობები	ნაკლოვანებები
შემთხვევითი Იზოლაცია	მიკრომანიპულაცია	დაბალი აღჭურვილობის მოთხოვნები მარტივი ოპერაცია	დაბალი ეფექტურობა იზოლირებული უჯრედების შეზღუდული ტიპები
	ლაზერული აღების მიკროდისექცია	მაღალი პოზიციონირების სიზუსტე მარტივი ოპერაცია ვიზუალურად შეარჩიეთ ნიმუშიდან მსგავსი უჯრედები და მოაშორეთ მინარევები	ნიმუშის მომზადების რთული პროცესი ავტომატიზაციის შეუძლებლობა
	ფლუორესცენციით გააქტიურებული უჯრედების დახარისხება	მაღალი სიზუსტე და ეფექტურობა ავტომატიზაციის მაღალი ხარისხი ფართო გამოყენება	რთული ოპერაცია მაღალი აღჭურვილობის მოთხოვნები
ანტიგენის შერჩევითი იზოლაცია	ფლუოროქრომით მონიშნული ანტიგენები მრავალპარამეტრიანი გზით	მაღალი სიზუსტე და ეფექტურობა ავტომატიზაციის მაღალი ხარისხი მაღალი გამტარუნარიანობა და მრავალპარამეტრიანი B უჯრედების იზოლირების შესაძლებლობა სხვადასხვა ეტაპზე	რთული ოპერაცია მაღალი აღჭურვილობის მოთხოვნები
	ანტიგენით დაფარული მაგნიტური მძივები	მარტივი ოპერაცია მაღალი განმეორებადობა შეუძლია სამიზნე B უჯრედების გამდიდრება	რთული ოპერაცია მაგნიტური მძივები გავლენას ახდენს უჯრედების ბიოლოგიურ აქტივობაზე და არ უწყობს ხელს იზოლაციის შემდეგ კულტივირებასა და ფუნქციონირებას.
	მიკროგრავირება	მაღალი ეფექტურობა მაღალი სიჩქარე	მაღალი აღჭურვილობის მოთხოვნები დაბალი ეფექტურობა
	იმუნოსპოტური მასივის ანალიზი ჩიპზე	ავტომატიზაციის მაღალი ხარისხი მაღალი სიზუსტე და ეფექტურობა	რთული ოპერაცია მაღალი ღირებულება

ერთჯერადი B უჯრედების სკრინინგის ანტისხეულების სერვისის პროცესი

ცხოველთა იმუნიზაცია

იმუნური სტიმულაციისთვის ექსპერიმენტული ცხოველებისთვის (მაგალითად, თაგვები, კურდღლები და ა.შ.) შეარჩიეთ შესაბამისი ანტიგენი, რათა მათ შეძლონ ანტიგენის საწინააღმდეგო სპეციფიკური ანტისხეულების გამომუშავება.

ცხოველთა იმუნიზაცია ანტისხეულების გენერირების საწყისი ეტაპია. ცხოველთა იმუნიზაცია არის ორგანიზმის ჰუმორული იმუნური პასუხის მექანიზმის გამოყენება, ანტიგენების უწყვეტი სტიმულაციის გზით, ცხოველები ძლიერ იმუნურ პასუხს გამოიმუშავებენ და შემდეგ სპეციფიკურ ანტისხეულებს გამოყოფენ სპეციფიკური ანტისხეულების საწინააღმდეგოდ.

B უჯრედების შეგროვება და გამდიდრება

B უჯრედები იზოლირებული იქნა იმუნური ცხოველების პერიფერიული სისხლიდან, ელენთიდან ან ლიმფური კვანძებიდან. ეს B უჯრედები იმუნოლოგიურად სტიმულირებული იქნა სპეციფიკური ანტიგენების საწინააღმდეგო ანტისხეულების გამოსამუშავებლად.

ფიზიკური ან ქიმიური მეთოდებით (როგორიცაა სიმკვრივის გრადიენტის ცენტრიფუგირება, მაგნიტური მძივების გამოყოფა და ა.შ.) B უჯრედების გამდიდრება, მინარევების მოცილება, B უჯრედების სისუფთავის გაუმჯობესება და შემდგომი გამოყოფის ეფექტურობა.

სურ. 1. კურდღლის მონოკლონური ანტისხეულის კლონირება და მომზადება. წყარო:B უჯრედების კლონირება და კურდღლის მონოკლონური ანტისხეულების წარმოება.)

B უჯრედების დახარისხება

გამდიდრებული B უჯრედებიდან ინდივიდუალური B უჯრედების სკრინინგისთვის მიზნობრივი ანტისხეულების წარმოსაქმნელად შეიძლება გამოყენებულ იქნას ფლუორესცენციით გააქტიურებული უჯრედების დახარისხება (FACS), მაგნიტური უჯრედების გამოყოფა (MACS), მიკროფლუიდური უჯრედების დახარისხება (MCS) ან სხვა მაღალი გამტარუნარიანობის სკრინინგის ტექნიკა, ანტიგენ-სპეციფიკურ მარკირებასთან ერთად.

როდესაც ერთი B უჯრედი იზოლირებულია შერეული B უჯრედების პოპულაციიდან, მისი ანტისხეულების გენები უნდა იყოს სეკვენირებული ერთი უჯრედის სეკვენირების ტექნოლოგიით და გაანალიზებული მძიმე ჯაჭვის ცვლადი რეგიონის (VH) და მსუბუქი ჯაჭვის ცვლადი რეგიონის (VL) დნმ-ის თანმიმდევრობის ინფორმაციის მისაღებად. ერთი უჯრედის სეკვენირების ტექნოლოგია ძირითადად მოიცავს სამ ეტაპს: ერთი უჯრედის იზოლაცია, უჯრედშიდა ნუკლეინის მჟავის ამპლიფიკაცია და სეკვენირების ანალიზი. ერთი უჯრედის სეკვენირების პრინციპია იზოლირებული ერთი უჯრედის მთელი გენომის დნმ-ის ან რნმ-ის კვალის ამპლიფიკაცია, რათა მივიღოთ სრული გენომი ან ტრანსკრიპტომი მაღალი გამტარუნარიანობის სეკვენირებისთვის.

მაღალი გამტარუნარიანობის სკრინინგის საშუალებით, ერთდროულად შესაძლებელია ათასობით B უჯრედის ანტისხეულების გენის თანმიმდევრობის მიღება, რაც მნიშვნელოვნად აჩქარებს ანტისხეულების აღმოჩენის სიჩქარეს. ამ თანმიმდევრობის ინფორმაციის შემდგომი გამოყენება შესაძლებელია ანტისხეულების ბიბლიოთეკის შექმნისა და სკრინინგისთვის.

სურ. 2. ცალკეული B უჯრედების აღების, ბიბლიოთეკის აგების, მაღალი გამტარუნარიანობის სკრინინგის და სეკვენირების სქემატური დიაგრამა.(საცნობარო წყარო: მასიურად პარალელური ერთუჯრედიანი B-უჯრედული რეცეპტორების სეკვენირება საშუალებას იძლევა მრავალფეროვანი ანტიგენ-რეაქტიული ანტისხეულების სწრაფი აღმოჩენის.)

ანტისხეულების გენის ამპლიფიკაცია

ერთი B უჯრედი იხლიჩება mRNA-ს გამოსაყოფად. შემდეგ, მძიმე ჯაჭვის ცვლადი რეგიონის (VH) და მსუბუქი ჯაჭვის ცვლადი რეგიონის (VL) cDNA თანმიმდევრობები ამპლიფიცირდება უკუ ტრანსკრიფციულ-პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციით (RT-PCR).

ანტისხეულების ექსპრესია და გაწმენდა

მონოკლონური ანტისხეულების ექსპრესიის პლაზმიდის ასაგებად, გამრავლებული ცვლადი რეგიონის გენი შეიყვანეს ვექტორულ პლაზმიდში მუდმივი რეგიონის გენით. შემდეგ, ექსპრესიისთვის შეირჩა შესაბამისი ექსპრესიის სისტემა (ეუკარიოტული ექსპრესიის სისტემა, როგორიცაა CHO უჯრედები ან პროკარიოტული ექსპრესიის სისტემა, როგორიცაა Escherichia coli) და მიღებული იქნა ბიოლოგიური აქტივობის მქონე მონოკლონური ანტისხეული. უჯრედული კულტურიდან ექსპრესირებული ანტისხეულების ექსტრაქციისა და გასაწმენდად და მაღალი ხარისხის რეკომბინანტული მონოკლონური ანტისხეულების მისაღებად გამოყენებული იქნა პროტეინ A აფინური ქრომატოგრაფია.

ანტისხეულების ვალიდაცია

ანტისხეულების სპეციფიკურობის, აფინურობისა და ბიოლოგიური აქტივობის ვალიდაცია ELISA-ს, Western blot-ის, Flow Analysis-ისა და იმუნოკოპრეციპიტაციის მეთოდებით, რათა უზრუნველყოფილი იყოს, რომ ანტისხეულების ეფექტურობა აკმაყოფილებს მოლოდინებს. ანტისხეულების ვალიდაცია ანტისხეულების ხარისხისა და სანდოობის უზრუნველყოფის მთავარი ნაბიჯია.

იმუნოგენის მოთხოვნები

(1) რეკომბინანტული ცილა: ≥2.5 მგ, ცილის სისუფთავე >85%, ცილის მოლეკულური წონა 10 კდა-ზე მეტი, ხსნადი ცილის კონცენტრაცია 0.5-დან 5 მგ/მლ-მდე. თუ საჭიროა ანტიგენის აფინურობის გაწმენდა, საჭიროა დამატებით 10 მგ რეკომბინანტული ცილა.

(2) პოლიპეპტიდები და მცირე მოლეკულები: შიშველი პეპტიდი ≥10 მგ, პეპტიდის სისუფთავე >90%, არანაკლებ 10 AA, შეერთება KLH/BSA/OVA ან სხვა მატარებელი ცილები; მცირე მოლეკულები წინასწარ საჭიროებენ სტრუქტურულ შეფასებას.

ცალკეული B უჯრედების დახარისხების სერვისის სამუშაო პროცესი

ნაბიჯები	სერვისის შინაარსი	ქრონოლოგია
ნაბიჯი 1: ცხოველთა იმუნიზაცია და ELISA-ს აღმოჩენა	(1) ცხოველები იმუნიზირებულნი იყვნენ 4-5-ჯერ, დაწყებული მე-4 დოზიდან, შრატი შეგროვდა ELISA-ს მეშვეობით ანტისხეულების ტიტრის დასადგენად (ცილის ანტიგენის ELISA შრატის ტიტრი >10^5; პეპტიდური ანტიგენის ELISA შრატის ტიტრი >10^4). ამავდროულად, მომხმარებლებს ტესტირებისთვის ეგზავნებათ 0.1 მლ იმუნიზაციამდელი და იმუნიზაციის შემდგომი შრატი; თუ ტიტრი არ არის კვალიფიციური, იმუნიზაცია გაგრძელდება ან კლიენტი მოითხოვს პროექტის შეწყვეტას და მხოლოდ იმუნიზაციის ნაწილი დაირიცხება; (2) თუ ტიტრი კვალიფიციური იყო, PBMC უჯრედები იზოლირებული იყო მთლიანი სისხლიდან.	10-12 კვირა
ნაბიჯი 2: ცალკეული B უჯრედების დახარისხება	(1) შეგროვდა ელენთა, მომზადდა B უჯრედების სუსპენზია, შეგროვდა პერიფერიული სისხლი და იზოლირებული იქნა PBMC უჯრედები. (2) იმუნოანტიგენური მარკერები FITC და AF648. (3) ორმაგი ფლუორესცენტული ნაკადური დახარისხება + ერთი b უჯრედის კლონის კულტურა. (4) დადებითი კლონების ELISA იდენტიფიკაცია + სეკვენირება.	2-3 კვირა
ნაბიჯი 3: ანტისხეულების ექსპრესია და ვალიდაცია	(1) 6-10 თანმიმდევრობის გენის სინთეზი + ძუძუმწოვრების ექსპრესიის ტესტის ვალიდაცია. (2) ELISA-ს იდენტიფიკაცია.	3-4 კვირა
ნაბიჯი 4: მიწოდება	(1) ანტისხეულების თანმიმდევრობები: 4-6 ანტისხეულების თანმიმდევრობა (გამოუხატავი თანმიმდევრობები ერთად მიეწოდება). (2) თითოეული ექსპრესირებული თანმიმდევრობა გამოყოფდა 0.2 მგ ანტისხეულს. (3) ექსპერიმენტული ანგარიში.	1 კვირა