친화도 측정 플랫폼

알파 라이프텍은 Octet 및 Biacore-T2000 플랫폼을 기반으로 신뢰할 수 있는 친화도 측정 서비스를 제공합니다. 항체, 세포, 단백질, 소분자 등 다양한 시료에 대한 친화도 측정 서비스를 제공합니다. 표면 플라스몬 공명(SPR) 및 생물층 간섭(BLI) 친화도 측정을 포함한 다양한 친화도 측정 방법이 있습니다.

알파 라이프텍은 ELISA와 친화도 측정을 결합한 전문적이고 정확한 친화도 측정 플랫폼을 보유하고 있으며, 전 세계 고객에게 전문적이고 효율적이며 신속하고 정확한 친화도 측정 결과를 제공합니다. 당사는 고객이 선택할 수 있는 두 가지 방법, 즉 신속 친화도 측정과 정밀 친화도 측정을 제공합니다. 신속 친화도 측정은 단일 농도 측정이며, 정밀 친화도 측정은 다양한 농도의 친화도를 측정할 수 있습니다. 다양한 저분자 화합물, 펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오타이드, 올리고머뿐만 아니라 지질, 박테리오파지, 바이러스, 세포 간의 상호작용 연구에 적용됩니다. 이 친화도 측정 플랫폼은 친화도 약물 검사 및 스크리닝, 항체 발굴의 기반을 마련하고 후속 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

바인딩 친화성 소개

친화도는 분자간 상호작용 평가, 친화도 약물 분석 및 약물 스크리닝에 중요합니다. 분자간 상호작용은 L + R = LR 방정식으로 나타낼 수 있습니다. 여기서 L은 자유 리간드, R은 결합되지 않은 수용체, LR은 결합된 리간드-수용체 복합체를 나타냅니다. 결합 반응은 분자간 상호작용을 정의하며, 평형에 도달할 때까지 반응 중 결합 상태와 비결합 상태 사이에서 동적 교환이 발생합니다. 이는 반응의 두 가지 속도 상수인 Kon(결합 속도 상수)과 Koff(해리 속도 상수)로 설명할 수 있습니다. 결합 상수(Ka)의 역수인 Kd 값은 반응 친화도에 중요한 상수인 Koff/Kon입니다. 따라서 두 분자 사이의 결합이 강할수록 친화도가 높아집니다. Kd 값이 작을수록 그 반대입니다. 이 방정식은 준대수 그래프에서 S자 곡선으로 나타낼 수 있으며, x축(대수 스케일 축)에는 리간드 농도를, y축에는 분율 경계를 둡니다. 점선은 결합 분율 0.5의 Kd(1 nM)에서의 리간드 농도를 나타냅니다.

그림 1: 세포 표면 수용체에 결합된 리간드의 농도 변화에 따른 시그모이드 결합 곡선. (참고 자료: Hunter SA, Cochran JR. 단백질-단백질 상호작용의 친화성을 결정하기 위한 세포 결합 분석: 기술 및 고려 사항.)

친화도 결정 방법

ELISA 결합 친화도 분석

항체 친화도 연구에 널리 사용되는 기술은 ELISA 방법을 기반으로 하며, 편리성, 속도, 간편성, 높은 민감도, 그리고 강력한 특이성을 특징으로 합니다. ELISA는 소량의 시약(즉, 항체와 항원)을 사용하여 정제 시약 없이 항체 친화도를 측정할 수 있습니다. 항원을 고체 표면에 고정하고 1차 항체를 사용하여 검출하면, 표지된 2차 항체가 1차 항체와 반응하여 효소면역측정법(ELISA) 판독기에서 데이터를 판독하고 분석합니다.

그림 2: 설계된 펩타이드가 표적에 결합하는지 평가하기 위한 ELISA 유사 분석법. (참고 출처: Hajikarimlou, Maryam 외, 2022. SARS-CoV-2 표면 단백질 S를 검출하는 펩타이드를 빠르게 설계하기 위한 계산적 접근 방식.)

표면 플라스몬 공명(SPR) 결합 친화도 분석

SPR 기술은 주로 굴절률 변화를 감지합니다. 전통적인 광학 현상과 빛의 공명 현상을 이용하여, 생체 분자 간 상호작용에 대한 바이오센싱 분석 기술을 구축하여 바이오센싱 칩에서 리간드와 분석 물질 간의 상호작용을 감지할 수 있습니다. 생물학적 반응 중 SPR 각도의 동적 변화를 모니터링하여 생체 분자 간의 결합 및 상호작용에 대한 특정 신호를 얻을 수 있습니다.

그림 3: H10/AGR2 결합에 대한 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석. (참고 자료: Garri, Carolina, et al., 2018. 전방 기울기 동족체 2(AGR2)에 대한 새로운 펩타이드의 식별, 특성화 및 응용.)

생물층 간섭(BLI) 결합 친화도 분석

바이오필름 간섭 기술은 분자 간 상호작용의 포괄적인 정량 분석 및 단백질 농도 측정에 주로 사용되는 무표지 실시간 모니터링 광학 검출 기술입니다. 이 기술은 프로브 기반 바이오센서를 사용하여 시료의 바이오필름 두께 변화를 직접 검출합니다. 간섭 스펙트럼의 변위 변화를 검출함으로써 센서 표면에서 상호작용하는 바이오 분자 간의 결합 및 해리를 감지하고, 간섭 스펙트럼의 실시간 변위(nm)를 표시합니다.

그림 4: aLDRG와 키티놀올리고당 사이의 생물층 간섭법(BLI) 분석. (참고 자료: Li, Bing, 2023. LysM 도메인을 중심으로 한 균류 공생에 참여하는 Armillaria sp. 541의 근형균과 균사 간의 비교 전사체의 특징.)

BLI와 SPR 기술 비교

기술 이름	BLI(생물층 간섭계)	SPR(표면 플라스몬 공명)
원칙	센서 표면에서 반사되는 빛의 간섭 패턴 변화를 측정하여 생체층의 광학적 두께 변화를 통해 분자 상호작용을 감지합니다. 실시간 결합 곡선(직접 측정)을 제공합니다.	센서 칩 표면 근처의 굴절률 신호 변화를 감지하여 분자 상호작용을 측정합니다(빛이 금과 유리 계면과 상호작용하여 굴절률 변화를 일으킬 때 발생). 데이터는 공진각의 변화로 반영됩니다(간접 측정).
제조업체	사르토리우스	GE
기구	포르테바이오 바이오센서	오픈 SPR 기기
체계	ForteBio Octet System(분자 상호작용 분석용)	TraceDrawer(스웨덴 Ridgeview Instruments에서 개발)
장점	1. 광범위한 시료 호환성과 뛰어난 안정성을 제공하며, 특히 소분자 검출에 적합합니다(시료 순도 및 완충액 조건에 대한 특정 요건이 덜 엄격함). SSA 칩은 결합 연구에 비용 효율적입니다. 2. SPR에 비해 처리량이 빠르고 실험 시간이 짧습니다.	1. BLI에 비해 개발 기간이 길어 민감도가 더 높습니다. 2. 희귀하거나 귀중한 단백질을 높은 친화도와 특이성 데이터로 검출하는 등 특정 응용 분야에 대한 더 높은 정밀도와 견고성.
단점	1. SPR에 비해 데이터 정확도가 약간 낮습니다. 2. 기구의 세심한 유지관리가 필요합니다. 3. SSA 칩 비용이 비교적 높습니다.	1. 매우 작은 분자를 검출하기 위한 완충 조건은 까다로울 수 있으며, 검출 실패의 위험이 커집니다. 2. 칩은 일반적으로 BLI에 사용되는 칩보다 비쌉니다. 3. 장시간 실험 중 샘플 증발이 문제가 될 수 있습니다.
칩 유형	SSA 칩	NTA 칩

친화도 측정 범위

친화도 측정에는 항원-항체(강한 항원-항체, 약한 항원-항체), 단백질-단백질, 단백질-펩타이드, 단백질-소분자, 단백질 DNA/RNA(압타머) 측정이 포함될 수 있습니다. KD를 측정할 때는 몰 농도 중 하나를 알아야 합니다. 소분자가 결합할 때, 한 분자의 분자량은 150달톤 이상이어야 합니다.

유형	범위	지침
1. 항원-항체	10^-6에서 10^-12까지	대부분의 항체의 Kd 값은 10^-6~10^-7에서 10^-9 사이입니다. 일반적으로 고친화도 항체는 10^-9 이내, 고친화도 항체는 10^-12 이내로 알려져 있습니다.
2. 단백질 - 소분자	10^-4에서 10^-5까지	소분자와 단백질의 KD는 10^-4와 10^-5 사이이고, 10^-3과 10^-7은 정상이며 10^-10에 도달할 수 없습니다. 공유 결합된 작은 분자는 10^-10에 도달할 수 있습니다.
3. 아비딘-비오틴	10^-14	친화성은 비특이적 결합을 쉽게 겪을 수 있으며, 스트렙타비딘이나 탈글리코실화된 친화성을 사용할 수 있습니다.
4. DNA-단백질	10^-8에서 10^-10까지	고품질의 완전한 DNA입니다. 전기영동의 영향을 받지 않도록 주의하세요.

친화도 결정을 위한 샘플 요구 사항

견본	요구 사항
1. 대형 분자 샘플	단백질 > 50µg, 항체 > 100µg, 비오틴화 단백질 > 200µg; 비오틴이 없는 단백질 > 2mg, 순도 요구량 > 90%, 완충액: PBS, HEPBS. 이미다졸기를 함유할 수 없으므로 품질 관리가 필요합니다.
2. 소분자 샘플	1mg 이상, 분말 또는 액상. 액상은 물이나 DMSO에 용해되어야 합니다. 글리세롤, 이미다졸, 트레할로스 또는 기타 염류는 포함하지 않도록 합니다. 완충액에 트리스(Tris)와 같이 아미노기를 갖는 시약은 피해야 하며, 일반적으로 PBS, HEPPS 등이 유기 시약 없이 사용됩니다.

Affinity Measurement Platform의 장점

다중 샘플 분석

Alpha Lifetech는 항체, 세포, 단백질 및 기타 생체 분자를 포함한 다양한 샘플에 대한 친화성 분석을 제공할 수 있습니다.

성숙한 기술 플랫폼

우리는 SPR 결합 분석, BLi 결합 분석, ELISA 결합 분석과 같은 첨단 기술을 보유하고 있습니다.

유연한 프로젝트 선택

고객은 빠른 친화도 결정과 정확한 친화도 결정 중에서 선택할 수 있습니다.

고정밀 결과

당사의 전문적인 기술팀은 효율적이고 정확하며 신뢰할 수 있는 친화도 측정 결과를 보장할 수 있습니다.

사례 연구사례

BLI 신속 친화도 분석 항체 및 앱타머 친화도 분석

SA 프로브 특이성을 갖는 바이오틴화된 압타머를 포획하여 용해합니다. 시료를 일정 농도로 용해 및 희석하고, 프로브 특이적으로 포획된 Target 1-5 압타머를 고형화한 후, 신호 포화 후 시료에 결합합니다. 그런 다음 96웰 플레이트에 첨가합니다.

그림 5: 96웰 플레이트 샘플의 검출 위치 분포. B는 센서의 밸런싱 및 분리에 사용되는 완충액을 나타냅니다. L: 바이오틴 타겟 1-5 압타머, 221: 샘플.

데이터의 안정성과 정확성을 확보하기 위해 드릴링에 주의하고, 해당 프로그램을 설정하여 결과를 얻으세요.

그림 6: Target 1, 2, 3 앱타머와 샘플 간의 상호작용 피팅 다이어그램. (CH 1 \ 3 \ 5는 응고된 Target 1 \ 2 \ 3 앱타머 프로브와 샘플 간의 상호작용 신호와 데이터를 나타냅니다.)

그림 7: Target 4 및 5 앱타머와 샘플 간의 상호작용 피팅 다이어그램. (CH 1 \ 3은 응고된 Target 4 \ 5 앱타머 프로브와 샘플 간의 상호작용 신호와 데이터를 나타냅니다.)

결과는 보여줍니다

다음과 같은 결과가 얻어졌습니다. 피팅 후 Target 1 어댑터의 샘플에 대한 친화도는 9.41 ^ -8이었습니다. 피팅 후 Target 2 어댑터의 샘플에 대한 친화도는 8.32 ^ -8이었습니다. 피팅 후 Target 3 어댑터의 샘플에 대한 친화도는 8.64 ^ -8이었습니다. 피팅 후 Target 4 어댑터의 샘플에 대한 친화도는 3.70 ^ -8이었습니다. 피팅 후 Target 5 어댑터의 샘플에 대한 친화도는 3.01 ^ -8이었습니다.

궁금한 사항이 있으시면 언제든지 문의해 주시기 바랍니다.