라이브러리 구축에 사용되는 파지에는 필라멘트형 파지(M13 파지), T7 파지, T4 파지, λ 파지 등이 있습니다. 파지마다 발현되는 펩타이드의 복제 수, 길이, 발현 부위, 아미노산 선호도가 다릅니다. 현재는 아미노 말단에 발현되는 필라멘트형 파지와 카르복실 말단에 발현되는 T7 파지가 널리 사용되고 있습니다. 이들은 무작위 아미노산 펩타이드 라이브러리를 발현하고 항체 가변 영역 라이브러리를 구축하는 데 활용될 수 있습니다.

M13 파지 디스플레이 시스템은 M13 파지를 이용하여 외래 펩타이드 또는 단백질을 발현시키는 기술입니다. 박테리오파지 M13은 단백질 껍질과 원형 단일 가닥 DNA로 구성된 비용해성 사상형 파지입니다. 캡시드 단백질(pIII, pVI, pVII, pVIII 및 pIX) 부위를 이용하여 디스플레이 방법을 구축할 수 있으며, 그중 pIII 및 pVIII 단백질이 가장 일반적인 디스플레이 부위입니다.

pIII 단백질은 파지의 말단에 위치하며 분자량이 크다. 이 단백질은 외부 펩타이드나 단백질에 삽입될 수 있어 널리 사용된다. 그러나 pIII 매개 디스플레이는 다가성 디스플레이이기 때문에 고친화성 융합 파지 선별에는 적합하지 않으며, 일부 단백질의 디스플레이율이 낮아 파지의 감염 능력에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 안정성과 디스플레이 효율을 향상시키기 위한 파지 디스플레이 시스템이 개발되었다.

pVIII 단백질은 M13 파지의 주요 캡시드 단백질로, 파지의 양쪽에 위치하며 분자량이 작습니다. pVIII 매개 발현은 일반적으로 외래 서열을 N-말단에 융합시키며, 융합 펩타이드의 길이는 제한적이지만, 외래 융합 단백질의 복제 수는 많아 친화도가 낮은 펩타이드를 선별하는 데 적합합니다.

T4 파지 디스플레이 시스템은 T4 병원성 파지의 캡시드 단백질을 이용하여 외래 펩타이드 또는 단백질을 발현시키는 기술입니다. T4 파지는 정이십면체 머리와 수축 가능한 꼬리로 구성되어 있으며, 유전자는 선형 이중 가닥 DNA입니다. 캡시드 표면의 비필수적 보조 단백질인 SOC와 HOC는 발현에 자주 이용되며, 이 두 단백질의 존재 여부는 파지 활성에 영향을 미치지 않습니다. T4 파지는 SOC 또는 HOC의 한 부위에 발현될 수도 있고, 서로 다른 외래 서열을 두 부위에 동시에 발현시킬 수도 있습니다. 이 시스템은 숙주 세포 내에서 조립되며 다양한 표적 단백질을 발현시킬 수 있습니다. 최대 35kb의 발현 용량과 높은 복제 수를 제공하지만, 고친화성 리간드 스크리닝에는 적합하지 않습니다.

T7 파지 디스플레이 시스템은 T7 용균성 파지의 10B 캡시드 단백질을 이용하여 외래 펩타이드 또는 단백질을 발현시키는 시스템입니다. T7 파지는 빠르게 안정적으로 증식하며, 게놈은 선형 이중 가닥 DNA입니다. 10B 단백질은 파지 표면에 위치하며, C-말단에 외래 서열을 융합하여 발현시킬 수 있습니다. 이 시스템은 짧은 펩타이드를 높은 복제 수로 발현시킬 뿐만 아니라, 긴 서열도 낮은 복제 수로 발현시킬 수 있으며, 스크리닝 조건을 필요에 따라 선택할 수 있습니다. T7 파지는 숙주 세균을 용해시켜 자손을 방출하므로 발현 ​​가능한 펩타이드의 종류에 제약이 적고, 빠르게 증식하여 스크리닝 시간이 짧습니다. 또한, T7 파지는 열악한 환경에서도 안정적으로 증식할 수 있어 복잡한 환경에서의 스크리닝에 적합합니다.

λ 파지 디스플레이 시스템은 λ 파지의 D 단백질과 V 단백질을 이용하여 외래 단백질을 발현시킨다. λ 파지는 정이십면체 머리와 가느다란 꼬리로 구성되어 있으며, 게놈은 선형 이중 가닥 DNA이다. D 단백질은 머리 부분의 주요 단백질이고, V 단백질은 꼬리 부분의 주요 단백질이다. 이 두 단백질은 모두 특정 말단에 외래 단백질을 결합시킬 수 있다. 여러 개의 결합 부위가 존재하기 때문에 높은 친화성을 가진 펩타이드나 단백질을 선별하기는 어렵다. 그러나 λ 파지는 숙주 세포 내에서 조립된 후 방출되어 더 넓은 범위의 펩타이드를 발현시킬 수 있으므로, 복잡한 구조의 거대 분자나 숙주에 독성을 나타내는 단백질도 발현시킬 수 있다.

그림 2. 파지 디스플레이에 사용되는 박테리오파지의 종류. (참고 자료: 파지 디스플레이 및 기타 펩타이드 디스플레이 기술)

림프구 집단(예: 인간 말초혈액 림프구, 림프절 세포 또는 비장 세포)에서 총 RNA를 추출했습니다. 추출된 mRNA는 역전사 기법을 이용하여 cDNA로 역전사했습니다.

특정 프라이머를 설계하여 cDNA를 주형으로 사용하여 PCR을 통해 항체 중쇄(Fd) 및 경쇄 가변 영역 유전자(Fab 라이브러리의 경우) 또는 VH 및 VL 단편(scFv 라이브러리의 경우)을 증폭했습니다. PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고 목표 유전자 단편을 회수했습니다.

표적 유전자 단편은 파지미드 벡터에 클로닝되었으며, 유전자 단편은 일반적으로 효소 소화 및 연결을 통해 벡터에 연결되었습니다. Fab 라이브러리의 경우, Fd 단편과 경쇄 유전자를 각각 클로닝하여 완전한 Fab 구조로 결합해야 합니다. scFv 라이브러리의 경우, VH 및 VL 단편은 PCR 중첩 확장법을 통해 직접 접합할 수 있습니다.

라이게이션 생성물을 대장균 형질전환 세포에 전기천공법으로 도입하여 표적 항체 단편을 포함하는 대장균 라이브러리를 구축하였다. 형질전환된 세포를 한천 배양 접시에 도포하여 하룻밤 배양한 후, 세포를 긁어내어 글리세롤에 보관하여 세균 라이브러리를 형성하였다.

세균 라이브러리의 세포들을 증폭시키고 헬퍼 파지로 초염색하여 파지 표면에 표적 항체 단편을 발현시켰다. 상층액을 수집하였고, 이것이 파지 디스플레이 라이브러리였다.

표적 자기 비드 결합. PBST로 세척한 후, 음성 스크리닝을 위해 자기 비드 50μL에 파지 용액을 첨가하고, 양성 스크리닝과 동일한 조건으로 배양하였다. 그 후, 상층액을 수집하여 양성 스크리닝을 수행하였다. 위의 음성 스크리닝 후 얻은 파지 상층액을 준비된 표적 자기 비드에 첨가하여 배양하였다. 파지 용액을 버리고 PBST로 3-5회 세척하였다. 용출액을 넣고 정치시킨 후, pH 7.0 정도로 빠르게 중화시켰다. 용출액 파지 역가 측정: 파지 용액 10μL를 2×YT 배지로 10배 희석하고, 적절히 희석된 시료 100μL를 대수 성장기 TG1 세포 100μL에 첨가하여 잘 혼합한 후, 37°C에서 15분간 배양하여 감염시켰다. 다양한 희석 농도의 파지를 감염시킨 TG1 세포를 LB/AMP-GLU 배지에 고르게 도말하고 37°C에서 8시간 동안 배양하였다. 배지 상의 콜로니 수를 세어 재조합 파지의 역가를 계산하였다. 용출된 파지 용액을 대수 성장기 TG1 세포에 다시 감염시키고 대수 성장기까지 배양하였다. 헬퍼 파지 M13K07을 2×YT/AMP-KAN 배지에 현탁시켜 배지에 첨가하고 진탕 배양기에서 14시간 동안 배양하였다. 이후 스크리닝을 위해 위의 단계를 반복하였다.

96웰 마이크로플레이트를 준비하고, 각 웰에 희석된 표적 용액(코팅 용액) 100 μL를 첨가하여 4 °C에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 코팅액을 제거하고, 각 웰에 탈지분유를 첨가한 후 실온에서 밀봉하였다. PBST로 4회 세척한 후, 제조된 파지 용액을 마이크로플레이트에 첨가하고 실온에서 배양하였다. 결합되지 않은 파지 시료는 제거하고, PBST로 세척한 후 PBS로 다시 세척하였다. 용출액을 pH 7.0 정도로 빠르게 중화시켰다. 용출액 내 재조합 파지의 역가를 측정하였다. 용출된 파지 용액을 대수 성장기 TG1 균주에 접종하고 대수 성장기까지 배양하였다. 헬퍼 파지 M13K07을 2 × YT/AMP-KAN 배지에 현탁하여 배지에 첨가하고 진탕 배양기에서 14시간 동안 배양하였다. 추가 검사를 위해 위의 단계를 반복하십시오.

파지를 음성 스크리닝 세포에 첨가하고, 배양 조건은 양성 스크리닝과 동일하게 유지하였다. 그 후, 결합되지 않은 상층액 파지 라이브러리를 수집하여 이번 양성 스크리닝을 진행하였다. 음성 스크리닝 파지 상층액을 양성 스크리닝 세포에 첨가하고 4°C에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 세척하고 양성 체 세포를 회수하였다. 용출액을 첨가하여 파지를 용출시키고 파지 역가를 측정하였다. 용출된 파지 용액을 대수 성장기 TG1 균주에 감염시키고 대수 성장기까지 배양하였다. 헬퍼 파지 M13K07을 2×YT/AMP-KAN 배지에 현탁하여 배지에 첨가하고 진탕 배양기에서 14시간 동안 배양하였다. 이후 스크리닝을 위해 위의 단계를 반복하였다.

파지 디스플레이 기술을 통해 항체 가변 영역 유전자를 파지 게놈에 삽입하여 발현된 항체를 파지 표면에 발현시킴으로써 파지 디스플레이 항체 라이브러리를 구축할 수 있다. 이는 시험관 내에서 항체 생산 과정을 모방하고 임의의 항원에 대한 항체를 선별하는 데 활용될 수 있다.

파지 디스플레이 기술은 특정 생물학적 활성을 가진 분자를 선별하는 데 사용될 수 있으며, 이러한 분자는 향후 연구 개발을 위한 후보 약물로 활용될 수 있습니다. 예를 들어, 파지 디스플레이 스크리닝을 통해 질병 관련 단백질에 결합하는 분자를 발견할 수 있으며, 이는 해당 질병을 치료할 가능성을 제시합니다.

파지 디스플레이 기술을 이용하면 특정 병원체에 대한 백신 후보 분자를 제조할 수 있습니다. 이러한 분자는 병원체의 항원 에피토프를 모방하여 인체의 면역 반응을 유도함으로써 질병을 예방하는 효과를 얻을 수 있습니다.

파지 디스플레이 기술은 병원체 검출을 위한 프로브 라이브러리를 구축하는 데에도 사용될 수 있습니다. 이러한 프로브는 병원체 또는 관련 분자를 특이적으로 인식하고 결합하여 병원체를 신속하고 정확하게 검출할 수 있습니다.

파지 디스플레이 기술을 이용하면 특정 항체와 결합하는 항원 에피토프를 선별할 수 있습니다. 이는 항원의 구조와 기능, 그리고 항체와 항원 간의 상호작용 메커니즘을 이해하는 데 도움이 됩니다.

파지 디스플레이 기술은 세포 신호 전달 과정에서 분자 간 상호작용을 연구하는 데에도 활용될 수 있다. 파지 디스플레이 스크리닝을 통해 세포 신호 전달 관련 분자에 결합하는 분자를 찾아냄으로써 세포 신호 전달 메커니즘을 심층적으로 이해할 수 있다.

또한, 파지 디스플레이 기술은 단백질 리간드 스크리닝, 진단 및 검출 시약 제조, 면역 질환의 진단 및 치료 등 다양한 과학 연구 분야에서 널리 활용되고 있습니다.

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