Afiniteto matavimo platforma

Remdamasi „Octet“ ir „Biacore-T2000“ platforma, „Alpha Lifetech“ gali teikti patikimas afiniteto nustatymo paslaugas. Galime atlikti kelių mėginių, tokių kaip antikūnai, ląstelės, baltymai, mažos molekulės ir kt., afiniteto nustatymą. Yra įvairių afiniteto nustatymo metodų, įskaitant paviršiaus plazmonų rezonanso (SPR) ir biosluoksnio interferencijos (BLI) afiniteto nustatymą.

„Alpha Lifetech“ turi profesionalią ir tikslią afiniteto nustatymo platformą, kuri sujungia ELISA su afiniteto nustatymu, teikdama profesionalius, efektyvius, greitus ir tikslius afiniteto nustatymo rezultatus klientams visame pasaulyje. Klientams galime pasiūlyti du metodus: greitą afiniteto nustatymą ir tikslų afiniteto nustatymą. Greitas afiniteto nustatymas yra vienos koncentracijos nustatymas, o tikslus afiniteto nustatymas gali išmatuoti skirtingų koncentracijų afinitetą. Taikoma tiriant sąveiką tarp įvairių mažų molekulių junginių, peptidų, baltymų, oligonukleotidų ir oligomerų, taip pat lipidų, bakteriofagų, virusų ir ląstelių. Afiniteto matavimo platforma gali padėti pagrindą afinitetinių vaistų testavimui ir atrankai, antikūnų atradimui ir palengvinti vėlesnius tyrimus.

Įvadas į rišamąjį afinitetą

Afinitetas yra svarbus vertinant tarpmolekulines sąveikas, atliekant afininių vaistų tyrimus ir atliekant vaistų patikrą. Tarpmolekulines sąveikas galima apibūdinti lygtimis: L + R = LR, kur L reiškia laisvus ligandus, R reiškia nesurištus receptorius, o LR reiškia surištus ligandų-receptorių kompleksus. Prisijungimo reakcijos apibrėžia tarpmolekulines sąveikas, kai reakcijos metu vyksta dinaminiai mainai tarp surištos ir nesurištos būsenų, kol pasiekiama pusiausvyra. Tai galima apibūdinti dviem reakcijos greičio konstantomis: Kon (prisijungimo greičio konstanta) ir Koff (disociacijos greičio konstanta). Kd vertė, kuri yra atvirkštinė prisijungimo konstantai (Ka), yra Koff/Kon, svarbi reakcijos afiniteto konstanta. Todėl kuo glaudesnis ryšys tarp dviejų molekulių, tuo didesnis afinitetas. Kuo mažesnė Kd vertė, tuo atvirkščiai. Šią lygtį galima pavaizduoti kaip S formos kreivę pusiau logaritminiame grafike, kur ligandų koncentracija yra x ašyje (logaritminės skalės ašyje), o trupmeninė riba – y ašyje. Punktyrinė linija žymi ligando koncentraciją, kai Kd (1 nM) yra 0,5 surišimo frakcijos.

1 pav.: Įvairių prie ląstelės paviršiaus receptoriaus prisijungusių ligandų koncentracijų sigmoidinė prisijungimo kreivė. (Šaltinis: Hunter SA, Cochran JR. Ląstelių surišimo tyrimai baltymų ir baltymų sąveikos afinitetui nustatyti: technologijos ir svarstymai.)

Giminingumo nustatymo metodai

ELISA surišimo afiniteto tyrimas

Plačiai naudojama antikūnų afiniteto tyrimo technika yra pagrįsta ELISA metodu, kuriam būdingas patogumas, greitis, paprastumas, didelis jautrumas ir didelis specifiškumas. Jis gali naudoti nedidelį kiekį reagentų (t. y. antikūnų ir antigenų) ir išmatuoti antikūnų afinitetą nenaudojant gryninimo reagentų. Imobilizuojant antigeną ant kieto paviršiaus ir jį aptinkant naudojant pirminį antikūną, žymėtas antrinis antikūnas reaguoja su pirminiu antikūnu, kad nuskaitytų ir analizuotų duomenis imunofermentinės analizės (ELISA) skaitytuve.

2 pav.: ELISA tipo tyrimai, skirti įvertinti sukurtų peptidų prisijungimą prie jų taikinių. (Šaltinis: Hajikarimlou, Maryam ir kt., 2022. Skaičiavimo metodas, skirtas greitai sukurti peptidus, kurie aptinka SARS-CoV-2 paviršiaus baltymą S.)

Paviršiaus plazmonų rezonanso (SPR) surišimo afiniteto tyrimas

SPR technologija daugiausia aptinka lūžio rodiklio pokyčius. Pasitelkus tradicinius optinius reiškinius ir šviesos rezonanso reiškinį, galima sukurti biosensorinę biomolekulių sąveikos analizės technologiją, skirtą ligandų ir analitų sąveikai biosensoriniuose lustuose aptikti. Specifinius biomolekulių jungimosi ir sąveikos signalus galima gauti stebint dinaminius SPR kampų pokyčius biologinių reakcijų metu.

3 pav.: H10/AGR2 prisijungimo paviršiaus plazmonų rezonanso (SPR) analizė. (Šaltinis: Garri, Carolina ir kt., 2018. Naujo peptido, nukreipto prieš priekinį gradiento homologą 2 (AGR2), identifikavimas, apibūdinimas ir taikymas.)

Bio sluoksnio interferencijos (BLI) surišimo afiniteto tyrimas

Bioplėvelės interferencijos technologija – tai etikečių nereikalaujanti, realaus laiko stebėjimo optinio aptikimo technika, daugiausia naudojama išsamiai kiekybinei tarpmolekulinių sąveikų analizei ir baltymų koncentracijos nustatymui. Ši technologija naudoja zondo pagrindu veikiantį biosensorių, skirtą tiesiogiai aptikti bioplėvelės storio pokyčius ant mėginio. Aptikus interferencijos spektro poslinkio pokyčius, aptinkamas jutiklio paviršiuje sąveikaujančių biomolekulių jungimasis ir disociacija, ir rodomas interferencijos spektro poslinkis realiuoju laiku (nm).

4 pav.: Biosluoksnio interferometrijos (BLI) tyrimas tarp aLDRG ir chitinoligosacharidų. (Šaltinis: Li, Bing, 2023. Lyginamojo transkriptomo tarp Armillaria sp. 541, dalyvaujančių grybų simbiozėje, akcentuojant LysM domenus, požymiai.)

BLI ir SPR technologijų palyginimas

Technologijos pavadinimas	BLI (biosluoksnio interferometrija)	SPR (paviršiaus plazmonų rezonansas)
Principas	Matuoja jutiklio paviršiuje atsispindėjusios šviesos interferencinio modelio pokyčius, aptikdamas molekulinę sąveiką pagal biologinio sluoksnio optinio storio pokyčius. Pateikia realaus laiko jungimosi kreivę (tiesioginis matavimas).	Matuoja molekulių sąveiką aptikdamas signalo pokyčius lūžio rodiklio srityje šalia jutiklio lusto paviršiaus (atsiranda, kai šviesa sąveikauja su aukso ir stiklo sąsaja, sukeldama lūžio rodiklio pokyčius). Duomenys atsispindi kaip rezonansinio kampo pokyčiai (netiesioginis matavimas).
Gamintojas	Sartorius	GE
Instrumentas	ForteBio biosensoriai	Atviras SPR instrumentas
Sistema	„ForteBio“ oktetų sistema (molekulinės sąveikos analizei)	„TraceDrawer“ (sukūrė „Ridgeview Instruments“, Švedija)
Privalumai	1. Platus mėginių suderinamumas, puikus stabilumas, ypač mažų molekulių aptikimui (specifiniai mėginio grynumo ir buferio sąlygų reikalavimai yra ne tokie griežti). SSA lustai yra ekonomiškai efektyvūs jungimosi tyrimams. 2. Greitesnis našumas ir trumpesnis eksperimentinis laikas, palyginti su SPR.	1. Ilgesnė vystymosi istorija, pasižyminti didesniu jautrumu, palyginti su BLI. 2. Didesnis tikslumas ir patikimumas specifinėms reikmėms, pavyzdžiui, retų ar vertingų baltymų, turinčių didesnio afiniškumo ir specifiškumo duomenis, aptikimui.
Trūkumai	1. Duomenų tikslumas šiek tiek mažesnis, palyginti su SPR. 2. Reikalinga kruopšti instrumento priežiūra. 3. SSA lustų kaina yra gana didelė.	1. Buferio sąlygos labai mažoms molekulėms aptikti gali būti sudėtingos, todėl padidėja aptikimo nesėkmės rizika. 2. Lustai paprastai yra brangesni nei tie, kurie naudojami BLI. 3. Mėginio garavimas ilgų eksperimentų metu gali būti problema.
Lusto tipas	SSA lustas	NTA lustas

Giminingumo matavimo apimtis

Afiniteto nustatymas gali apimti antigeno-antikūno (stipraus antigeno-antikūno, silpno antigeno-antikūno), baltymo-baltymo, baltymo-peptido, baltymo-mažos molekulės ir baltymo DNR/RNR (aptamero) santykius. Matuojant KD, būtina žinoti vieną iš molinių koncentracijų. Kai jungiasi mažos molekulės, viena molekulinė masė negali būti mažesnė nei 150 daltonų.

Tipas	Taikymo sritis	Atsargumo priemonės
1. Antigenas-antikūnas	nuo 10^-6 iki 10^-12	Daugelio antikūnų Kd vertės yra nuo 10^-6-10^-7 iki 10^-9. Paprastai manoma, kad didelio afiniteto antikūnų Kd vertės yra 10^-9 ribose, o didelio afiniteto antikūnų – 10^-12 ribose.
2. Baltymai – mažos molekulės	nuo 10^-4 iki 10^-5	Mažų molekulių ir baltymų KD yra nuo 10^-4 iki 10^-5, o 10^-3 ir 10^-7 yra normalios vertės ir negali pasiekti 10^-10. Kovalentinės mažos molekulės gali pasiekti 10^-10.
3. Avidinas-biotinas	10^-14	Afinitetas gali lengvai jungtis nespecifiškai, todėl galima naudoti streptavidiną arba deglikozilintą afinitetą.
4. DNR-baltymas	nuo 10^-8 iki 10^-10	Aukštos kokybės ir visa DNR; būkite atsargūs, kad išvengtumėte elektroforezės įtakos.

Mėginio reikalavimai afiniteto nustatymui

Pavyzdys	Reikalavimai
1. Didelis molekulės mėginys	Baltymas > 50 µg, antikūnas > 100 µg, biotinilintas baltymas > 200 µg; baltymas be biotino > 2 mg, grynumo reikalavimas > 90 %, buferinis tirpalas: PBS, HEPBS. Negali turėti imidazolo grupių; reikalinga kokybės kontrolė.
2. Mažos molekulės mėginys	Kiekis >1mg, milteliai arba skystis, skystis turi tirpti vandenyje arba DMSO. Stenkitės, kad buferyje nebūtų glicerolio, imidazolo, trehalozės ar kitų druskų; stenkitės vengti reagentų su amino grupėmis, tokių kaip Tris, paprastai PBS, HEPPS ir kt. be organinių reagentų.

Afiniteto matavimo platformos privalumai

Kelių mėginių analizė

„Alpha Lifetech“ gali atlikti afiniteto tyrimus įvairiems mėginiams, įskaitant antikūnus, ląsteles, baltymus ir kitas biomolekules.

Brandžios technologijos platforma

Turime pažangias technologijas, tokias kaip SPR surišimo tyrimas, BLI surišimo tyrimas ir ELISA surišimo tyrimas.

Lankstus projektų pasirinkimas

Klientai gali rinktis tarp greito ir tikslaus giminingumo nustatymo.

Didelio tikslumo rezultatai

Mūsų profesionali techninė komanda gali užtikrinti efektyvius, tikslius ir patikimus giminingumo nustatymo rezultatus.

Atvejo analizėATVEJIS

BLI greito afiniteto antikūnų ir aptamero afiniteto tyrimas

Užfiksuokite biotinilintus aptamerus su SA zondo specifiškumu ir ištirpinkite juos. Ištirpinkite ir praskieskite mėginį iki fiksuotos koncentracijos, sukietinkite zondui būdingus užfiksuotus Target 1-5 aptamerus ir, pasiekus signalo prisotinimą, prijunkite juos prie mėginio. Tada sudėkite juos į 96 šulinėlių plokštelę.

5 pav.: 96 šulinėlių plokštelės mėginių aptikimo pozicijų pasiskirstymas. B reiškia buferį, naudojamą jutiklių balansavimui ir disociacijai. L: Biotino taikinio 1–5 aptamerai, 221: Mėginys.

Atkreipkite dėmesį į gręžimą, kad užtikrintumėte duomenų stabilumą ir tikslumą, ir nustatykite atitinkamą programą rezultatams gauti:

6 pav.: Sąveikos atitikimo diagrama tarp 1, 2 ir 3 taikinių aptamerų ir mėginių. (CH1 \3 \5 žymi sukietėjusio 1 \2 \3 taikinio aptamerų zondo ir mėginio sąveikos signalą ir duomenis.)

7 pav.: Sąveikos atitikimo diagrama tarp „Target 4“ ir „Target 5“ aptamerų ir mėginių. (CH1 \3 žymi sukietėjusio „Target 4 \5“ aptamero zondo ir mėginio sąveikos signalą ir duomenis.)

rezultatai rodo

Gauti šie rezultatai: „Target 1“ adapterio afinitetas mėginiui po pritaikymo buvo 9,41 ^ -8; „Target 2“ adapterio afinitetas mėginiui po pritaikymo yra 8,32 ^ -8; „Target 3“ adapterio afinitetas mėginiui po pritaikymo yra 8,64 ^ -8; „Target 4“ adapterio afinitetas mėginiui po pritaikymo yra 3,70 ^ -8; „Target 5“ adapterio afinitetas mėginiui po pritaikymo yra 3,01 ^ -8.

Jei turite klausimų, nedvejodami susisiekite su mumis bet kuriuo metu.

Leave Your Message

Rekomenduojama paslauga

0102