Fagų demonstravimo technologija – tai įterpti svetimą tikslinį geną į specifinę fago kapsidės baltymo poziciją ir ekspresuoti svetimą geną fago paviršiuje, nepaveikiant normalios fago funkcijos. Po kelių atrankos etapų galiausiai buvo gautas tikslinis baltymas, pasižymintis dideliu specifiškumu ir dideliu biologiniu aktyvumu.

Naudojant šią technologiją galima generuoti didelės talpos antikūnų bibliotekas. Atrankos ciklas yra trumpas, veikimo procesas paprastas, o taikymo sritis plati, todėl galima nustatyti optimalias tikslinių peptidų ar baltymų sekas. Su virusais susijusiose srityse tyrėjai gali atrasti antikūnus, kurie jungiasi prie kritinių virusinių epitopų, atrinkdami dideles antikūnų bibliotekas. Šis procesas gali trukdyti virusų patekimui, replikacijai ar imuninio atsako išvengimo mechanizmams, taip sukurdamas ligų gydymo pagrindą.

Fagų demonstravimo technologija yra plačiau naudojama nei hibridomų technologija, kuri apsiriboja nedidelio kiekio antikūnų prieš specifinius imunogenus gamyba. Priešingai, fagų demonstravimo technologija gali pateikti visą antikūnų biblioteką, gautą iš įvairių imuninių rūšių.

Fagų demonstravimo technologija turi platų pritaikymo spektrą, įskaitant patogeninių mikroorganizmų receptorių patikrą, baltymų sąveikos tyrimą, signalų perdavimo tarp ląstelių stebėjimą, gyvūnų ligų diagnozavimą ir vakcinų kūrimą, be kitų sričių.

Fagų demonstravimo technologija siūlo daug privalumų ir gali būti taikoma įvairiose srityse. Tačiau pagrindinis rekombinantinių antikūnų kūrimo naudojant fagų demonstravimo metodą iššūkis yra su procesu susijusios išlaidos ir sudėtingumas. Šis metodas reikalauja integruoti molekulinės biologijos metodus, įskaitant mutaciją, klonavimą ir ekspresiją, kartu su imunologine, biochemine ir biofizine analize, siekiant identifikuoti ir apibūdinti norimus antikūnus.

Antigeno pateikimas yra labai svarbi grandis. Antigeno pateikimo metodai daugiausia apima tiesioginį antigeno pateikimą dengta danga, netiesioginį antigeno pateikimą dengta danga, antigeno pateikimą atliekant ląstelių atranką, antigeno pateikimą per liposomas, nanofosfolipidinius diskus ir VLP.

Tiesioginio dengimo metodas yra gana paprastas, tačiau antigeno konformaciją lengva pakeisti, o netiesioginio dengimo operacija yra sudėtinga, tačiau ji gali išlaikyti antigeno konformaciją ir pagerinti pateikimo efektyvumą. Ląstelių atranka gali imituoti realią sceną in vivo, tačiau yra nespecifinio prisijungimo problema. Nanofosfolipidų diskas yra mažo dydžio, didelio patekimo efektyvumo ir gero stabilumo; VLP yra sulieti su antigenu arba apvynioti antigenu, todėl pasižymi dideliu imunogeniškumu ir saugumu, todėl gali sukelti stiprų imuninį atsaką.

Jei koncentracija per maža, sumažėja prisijungimo prie fago tikimybė, todėl sumažėja atrankos efektyvumas. Priešingai, per didelė koncentracija gali padidinti nespecifinio prisijungimo tikimybę, sustiprinti foninį signalą ir trukdyti identifikuoti teigiamus klonus.

Siekiant išvengti aukštos temperatūros, stiprių rūgščių ir šarmų, galima taikyti švelnų fiksavimo metodą. Netiesioginio dengimo metodas ir biotino-streptavidino sistema buvo naudojami siekiant sumažinti antigeno struktūros pažeidimus. Jei antigenas yra membraninis baltymas, jį galima eksponuoti ant nepažeistų ląstelių paviršiaus arba naudoti membraninei aplinkai imituoti, pavyzdžiui, nanodisko pagalba, kad būtų išlaikyta natūrali membraninio baltymo konformacija.

Be įprastų eksperimentų, tokių kaip ELISA, Western blotavimas (WB) ir imunofluorescencija (IF), paviršiaus plazmonų rezonanso (SPR) ir biosluoksnio interferometrijos (BLI) aptikimo metodai gali būti naudojami antikūnų ir antigenų prisijungimo ir disociacijos procesams stebėti realiuoju laiku, leidžiant nustatyti afiniteto ir kinetinius parametrus.

Fagų demonstravimas gali būti naudojamas didelio afiniteto monokloniniams antikūnams generuoti prieš įvairias antikūnus gaminančias rūšis, įskaitant, bet neapsiribojant, žmones, peles, žiurkes, triušius, vištas, kupranugarius, alpakas, karves, šunis, avis, beždžiones ir ryklius.

Pelių antikūnų bibliotekų kūrimo technologija yra gerai žinoma, ekonomiška ir trunka trumpai, todėl tinka preliminariai antikūnų patikrai ir fundamentiniams tyrimams. Triušių antikūnai pasižymi stipriu afinitetu ir specifiškumu, o epitopų atpažinimo diapazonas platesnis, palyginti su pelių antikūnais. Žmogaus antikūnus galima gauti tiesiogiai iš žmogaus antikūnų bibliotekų, taip išvengiant galimų imuninių reakcijų, kurios gali kilti, kai žmogaus organizmui skiriami heterologiniai antikūnai. Šis metodas yra labai vertingas vaistų tyrimuose ir kūrime, ypač kuriant terapinius antikūnus.

Gyvūnų imunogenai paprastai skirstomi į baltymų antigeną, polipeptidinį antigeną, nukleorūgščių antigeną ir su patogenu susijusį antigeną, tarp kurių su patogenu susijęs antigenas apima viruso antigeną (pilną viruso dalelę, viruso baltymą, viruso nestruktūrinį baltymą ir kt.), bakterijų antigeną (pilną bakterijų ekstraktą, ląstelės sienelės komponentą, išskiriamą baltymą, toksiną ir kt.) ir parazito antigeną.

Koreguoti imunogenus, pakeičiant imuninius antigenus rekombinantiniais baltymais ir pakeičiant gaisrą gesinančias viruso daleles virusų struktūriniais baltymais. Koreguoti eksperimento planą ir modifikuoti imuninę dozę.

Imunogeniškumą galima sustiprinti sujungiant antigenus su baltymais-nešikliais, tokiais kaip galvijų serumo albuminas. Be to, imuniniai adjuvantai, įskaitant Freundo adjuvantą ir aliuminio adjuvantą, gali būti naudojami siekiant pailginti rezidavimo laiką in vivo ir stimuliuoti imuninių ląstelių aktyvaciją bei proliferaciją, taip pagerinant imunogeniškumą.

Fagų antikūnų biblioteka yra įvairių fagų antikūnų rinkinys, sukurtas surenkant visą kintamųjų sričių genų rinkinį iš antikūnų į fagų vektorius ir ekspresuojant juos fagų paviršiuje. Šio proceso metu susidaro fagų antikūnų biblioteka.

Bendras fagų demonstravimo procesas apima kelis pagrindinius etapus: periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių (PKML) išskyrimą iš imunizuotų gyvūnų, bendros RNR išskyrimą ir jos transkribavimą į komplementarinę DNR (kDNR), tikslinio geno amplifikavimą naudojant polimerazės grandininės reakcijos (PGR) technologiją, tikslinio geno klonavimą į fagų vektorių ir vektoriaus transformavimą į šeimininko ląstelę ekspresijai. Šio proceso metu sukuriama fagų demonstravimo biblioteka, kuri gali greitai identifikuoti didelio afiniteto antikūnus. Vėliau ši biblioteka gali būti vertingas šaltinis kuriant vakcinas, terapinius vaistus ir diagnostinius reagentus.

Pagal antikūnų bibliotekos šaltinį, fagų antikūnų bibliotekas galima suskirstyti į imuninių fagų antikūnų bibliotekas ir natūralių fagų antikūnų bibliotekas. Pagrindinis skirtumas tarp šių dviejų tipų yra tai, ar gyvūnai buvo vakcinuoti. Be to, natūralios antikūnų bibliotekos gali būti generuojamos pusiau sintezės arba sintezės būdu.

Yra du pagrindiniai antikūnų bibliotekos kokybės vertinimo rodikliai: saugojimo talpa ir įvairovė. Didelė saugojimo talpa kartu su didele įvairove užtikrina efektyvų antikūnų, pasižyminčių dideliu afinitetu ir specifiškumu, atranką.

Biologinės elutriacijos metu demonstracinė biblioteka inkubuojama su fiksuotais taikiniais, o po to kruopščiai plaunama, kad būtų pašalinti nereaktyvūs fagai. Konjugatai paprastai eliuojami naudojant rūgštinį arba daug druskos turintį tirpalą ir vėliau amplifikuojami tinkamose šeimininko ląstelėse praturtinimui. Po 3–5 atrankos ciklų gaunami didelio afiniteto antikūnai.

Fagų atrankos metodai daugiausia apima kietosios fazės panavimą, skystosios fazės atranką ir ląstelių pagrindu atliekamą atranką. Renkantis tinkamą atrankos metodą, reikėtų atsižvelgti į tikslinių molekulių savybes, atrankos proceso tikslus ir laboratorijos aplinką.

Teigiamas atrankos metodas yra pats fundamentaliausias fagų antikūnų, kurie jungiasi prie tikslinių baltymų, atrankos metodas. Neigiamas atrankos metodas padeda pašalinti nespecifinius antikūnus. Fagų antikūnų atrankos proceso metu nespecifiniai antikūnai gali būti identifikuoti dėl interferencijos, kurią sukelia tikslinio antigeno žymė, medžiagos ar kiti antigenai, turintys struktūrinių panašumų su tiksliniu antigenu. Tokiais atvejais neigiamas atrankos metodas gali padidinti atrankos proceso efektyvumą.

Antikūnų patvirtinimo metodai paprastai apima ELISA, Western blotavimą (WB), srauto citometriją, imunoprecipitaciją (IP), imunofluorescenciją (IF), imunohistochemiją ir įvairius kitus eksperimentinius metodus. „Alpha Lifetech“ turi didelę antikūnų nustatymo patirtį ir profesionalią eksperimentų komandą, užtikrinančią antikūnų veiksmingumą vėlesniuose eksperimentuose.