Kas yra antikūnų inžinerija?

Antikūnų inžinerijos pagalba buvo įmanoma modifikuoti antikūnų molekulinį dydį, farmakokinetiką, imunogeniškumą, prisijungimo afinitetą, specifiškumą ir efektorinę funkciją. Susintetinus antikūnus, specifinis jų prisijungimas daro juos labai vertingus klinikinėje diagnostikoje ir gydyme. Antikūnų inžinerijos pagalba jie gali patenkinti vaistų ir diagnostikos ankstyvosios plėtros poreikius.

Antikūnų inžinerijos tikslas – sukurti ir pagaminti labai specifines, stabilias funkcijas, kurių natūralūs antikūnai negali atlikti, taip padėdami pagrindą terapinių antikūnų gamybai.

„Alpha Lifetech“, turėdama didelę antikūnų inžinerijos projektų patirtį, gali teikti pritaikytas monokloninių ir polikloninių antikūnų paslaugas įvairioms rūšims, taip pat fagų demonstravimo antikūnų bibliotekų kūrimo ir atrankos paslaugas. „Alpha Lifetech“ gali suteikti klientams kokybiškus biologiškai panašius antikūnus ir rekombinantinius baltymų produktus, taip pat atitinkamas paslaugas, skirtas efektyviems, labai specifiškiems ir stabiliems antikūnams gaminti. Naudodami išsamias antikūnų, baltymų platformas ir fagų demonstravimo sistemas, teikiame paslaugas, apimančias antikūnų gamybos pradinius ir galutinius etapus, įskaitant technines paslaugas, tokias kaip antikūnų humanizavimas, antikūnų gryninimas, antikūnų sekoskaita ir antikūnų patvirtinimas.

Antikūnų inžinerijos novatoriškas etapas susijęs su dviem technologijomis:

--Rekombinantinės DNR technologijos

--Hibridomos technologija

Spartus antikūnų inžinerijos vystymasis susijęs su trimis svarbiomis technologijomis:

--Genų klonavimo technologija ir polimerazės grandininė reakcija

--Baltymų raiška: Rekombinantiniai baltymai yra gaminami raiškos sistemų, tokių kaip mielės, lazdelės formos virusai ir augalai.

--Kompiuterinis konstrukcijų projektavimas

Pirmosios kartos antikūnai buvo humanizuoti chimerinių antikūnų gamybai, kur kintamas pelių monokloninių antikūnų regionas buvo sujungtas su pastoviu žmogaus IgG molekulių regionu. Antrosios kartos pelių monokloninių antikūnų antigeną surišantis regionas (CDR) buvo persodintas į žmogaus IgG. Išskyrus CDR regioną, visi kiti antikūnai yra beveik žmogaus antikūnai, ir buvo stengiamasi išvengti žmogaus antikūnų prieš pelę (HAMA) atsako sukėlimo, kai žmonių gydymui naudojami pelių kloniniai antikūnai.

 

Norint sukurti fagų demonstravimo biblioteką, pirmiausia reikia gauti antikūnus koduojančius genus, kuriuos galima išskirti iš imunizuotų gyvūnų B ląstelių (imuninės bibliotekos kūrimas), išgauti tiesiai iš neimunizuotų gyvūnų (natūralios bibliotekos kūrimas) arba net surinkti in vitro su antikūnų genų fragmentais (sintetinės bibliotekos kūrimas). Tada genai amplifikuojami PGR metodu, įterpiami į plazmides ir ekspresuojami tinkamose šeimininko sistemose (mielių ekspresija (dažniausiai Pichia pastoris), prokariotų ekspresija (dažniausiai E. coli), žinduolių ląstelių ekspresija, augalų ląstelių ekspresija ir vabzdžių ląstelių, užkrėstų lazdelės formos virusais, ekspresija). Dažniausiai naudojama E. coli raiškos sistema, kuri integruoja specifinę koduojančią antikūnų seką į fagą ir koduoja vieną iš fago apvalkalo baltymų (pIII arba pVIII). Genų susiliejimas ir eksponavimas bakteriofagų paviršiuje. Šios technologijos esmė – sukurti fagų demonstravimo biblioteką, kuri, palyginti su natūraliomis bibliotekomis, turi pranašumą tuo, kad gali specifiškai prisijungti. Vėliau antikūnai, pasižymintys antigeno specifiškumu, yra atrenkami taikant biologinės atrankos procesą, tiksliniai antigenai fiksuojami, nesurišti fagai pakartotinai nuplaunami, o surišti fagai nuplaunami tolesniam sodrinimui. Po trijų ar daugiau pakartojimų ciklų išskiriami didelio specifiškumo ir didelio afiniteto antikūnai.

3 pav.: Antikūnų bibliotekos sudarymas ir atranka

Rekombinantinės DNR technologijos pagalba galima gauti antikūnų fragmentus. Fab antikūnus iš pradžių gali hidrolizuoti tik skrandžio proteazė, susidarant (Fab')2 fragmentams, kurie vėliau virškinami papainu, susidarant atskiriems Fab fragmentams. Fv fragmentą sudaro VH ir VL, kurie yra prastai stabilūs dėl disulfidinių jungčių nebuvimo. Todėl VH ir VL yra sujungti trumpu 15–20 aminorūgščių peptidu ir sudaro vienos grandinės kintamo fragmento (scFv) antikūną, kurio molekulinė masė yra maždaug 25 kDa.

Tyrimai, atlikti su kupranugarinių (kupranugarinių, lipų ir alpakų) antikūnų struktūra, parodė, kad antikūnai turi tik sunkiąsias grandines ir neturi lengvųjų grandinių, todėl jie vadinami sunkiosios grandinės antikūnais (hcAb). Sunkiosios grandinės antikūnų kintamasis domenas vadinamas vieno domeno antikūnais arba nanokūnais arba VHH, kurių dydis yra 12–15 kDa. Kaip monomerai, jie neturi disulfidinių jungčių ir yra labai stabilūs, pasižymintys labai dideliu afinitetu antigenams.

5 pav.: Sunkiosios grandinės antikūnas ir VHH/nanokūnas

Laisvoji raiška ląstelėse naudoja natūralios arba sintetinės DNR raišką, kad būtų pasiekta baltymų sintezė in vitro, paprastai naudojant E. coli raiškos sistemą. Ji greitai gamina baltymus ir išvengia metabolinės bei citotoksinės naštos ląstelėms, gamindama didelius rekombinantinių baltymų kiekius in vivo. Ji taip pat gali gaminti baltymus, kuriuos sunku sintetinti, pavyzdžiui, tuos, kuriuos sunku modifikuoti po transliacijos arba sintetinti membraninius baltymus.