Aptamero charakteristikų analizės paslauga

„Alpha Lifetech“ jau daugelį metų teikia su aptamerais susijusias paslaugas ir šiuo metu gali pasiūlyti išsamias aptamerų kūrimo schemas, tokias kaip aptamerų sintezė, SELEX atranka, didelio našumo sekvenavimas ir aptamerų optimizavimas bei apibūdinimas. Remdamasi SELEX metodo pranašumais aptamerų atrankoje, „Alpha Lifetech“ išplėtė daugiau aptamerų atrankos metodų.

Įvadas į aptamero charakteristikų analizę

Giminingumo patvirtinimas

Optimizuotas aptamero afinitetas buvo patikrintas atitinkamais aptamero prisijungimo tyrimo metodais. Pavyzdžiai: izoterminė titravimo kalorimetrija (ITC), srauto citometrija (FCM) ir paviršiaus plazmonų rezonansas (SPR), mikrofluidika ir kt. Aptamero afinitetas paprastai išreiškiamas disociacijos konstanta (KD) – fizikiniu dydžiu, naudojamu molekulinės disociacijos laipsniui grįžtamojoje reakcijoje kiekybiškai įvertinti. Kuo mažesnė KD vertė, tuo kompleksas stabilesnis, t. y. tuo stipresnis afinitetas; atvirkščiai, kuo didesnė KD vertė, tuo kompleksas nestabilesnis ir tuo silpnesnis afinitetas. Šis žingsnis yra raktas į aptamero veikimo nustatymą, užtikrinant aptamero afiniteto brendimą ir galimybę praktiškai prisijungti prie tikslinės molekulės su dideliu afinitetu ir selektyvumu.

1 pav. Aptamero afininio brendimo procesas. Šaltinis:Kinghorn AB, Fraser LA, 2017.

Funkcijos patikrinimas

Be afiniškumo patikrinimo, reikia patikrinti aptamero funkciją. Tai apima aptamero stabilumo, specifiškumo ir sąveikos su kitomis molekulėmis konkrečioje aplinkoje patikrinimą. Funkcinio patikrinimo rezultatai tiesiogiai paveiks aptamerų vertę moksliniuose tyrimuose ir pramonėje.

Konkretus patikrinimas

Konkurencinis eksperimentas: aptamero gebėjimas prisijungti prie konkretaus taikinio yra įvertinamas kitų panašių taikinių akivaizdoje. Jei aptameras gali specifiškai prisijungti prie taikinio molekulės be kitų molekulių trukdžių, tai rodo, kad jis pasižymi dideliu specifiškumu.

Kryžminės reakcijos eksperimentas: aptameras jungiamas prie susijusių arba nesusijusių taikinių serijos, siekiant patikrinti, ar jis jungiasi tik prie konkretaus taikinio, ir taip patikrinti jo specifiškumą.

Stabilumo patikrinimas

Nukleazių skaidymo eksperimentas: Aptamerai buvo veikiami skirtingų nukleazių koncentracijų ir buvo stebimas jų skaidymas. Lyginant skaidymo laipsnį skirtingais laiko momentais, galima įvertinti aptamero antinukleazių skaidymo gebėjimą.

Temperatūros ir laiko stabilumo eksperimentas: aptameras buvo laikomas skirtingose temperatūros ir laiko sąlygose, siekiant stebėti jo struktūrinį ir funkcinį stabilumą. Tai padeda nustatyti optimalias aptamerų laikymo ir naudojimo sąlygas.

Biologinio aktyvumo identifikavimas

Tinkamas metodas paprastai parenkamas atsižvelgiant į konkretų nukleorūgšties aptamero taikymo tikslą.

(1) Molekulinio lygio tyrimai: naudojant molekulinės biologijos metodus, tokius kaip gelio elektroforezė, Western blot ir kt., siekiant aptikti kompleksus, susidariusius po aptamero susijungimo su tiksline molekule, arba aptikti aptamero sukeltus tikslinės molekulės ekspresijos lygio pokyčius.

(2) Ląstelių lygio tyrimai: naudojant ląstelių kultūros technologiją, aptameriai inkubuojami su tikslinėmis ląstelėmis, siekiant stebėti biologinius pokyčius, tokius kaip ląstelių morfologija, proliferacija ir apoptozė, ir įvertinti aptamerų biologinį aktyvumą.

(3) Gyvūnų modelių bandymai: Tinkamuose gyvūnų modeliuose nukleorūgščių aptameriai yra duodami injekcijomis arba vaistais, o gyvūnų fiziologiniai rodikliai ir patologiniai pokyčiai stebimi siekiant įvertinti aptamerų biologinį aktyvumą ir saugumą in vivo.