Monokloninių antikūnų kūrimo tarnyba

„Alpha Lifetech Inc.“gali atlikti epitopų prognozavimą, peptidų sintezę, baltymų ekspresiją, polikloninių arba monokloninių antikūnų gamybą, taip pat antikūnų išgryninimą iš ląstelių kultūros, ascito skysčio arba viso serumo.

„Alpha Lifetech Inc.“turi patirties teikdama klientams įvairias stabilių ląstelių linijų paslaugas, įskaitant hibridomos ląsteles, genomo redagavimo ląstelių linijas, numuštų ląstelių linijas ir raiškos ląstelių linijas. Stengiamės kiekvienam klientui pasiūlyti pažangias, individualiai pritaikytas ląstelių linijų paslaugas, o mūsų paslaugos yra patikrintos ir patikimos.

Antikūnų kūrimo strategija

1. Antigeno dizainas ir paruošimas
Šie antigenai gali būti baltymai, peptidai arba kitos molekulės. Imunogenų kūrimui reikalingas visapusiškas požiūris, apimantis antigenų struktūros, imunologijos ir tiekimo sistemų žinias. „Alpha Lifetech“ turi antigenų kūrimo technologiją, kuri gali sukurti imunogenus klientams, kuriems jų reikia.
„Alpha Lifetech“ siūlo rekombinantinių baltymų produktus, iš kurių klientai gali rinktis. Turime įvairių baltymų ekspresijos sistemų, tokių kaip E. coli ekspresijos sistema, mielių ekspresijos sistema, bakuloviruso ir vabzdžių ekspresijos sistema, žinduolių ekspresijos sistema ir kt., kad galėtume pagaminti rekombinantinius baltymus, kurių jums reikia tyrimams.

2. Gyvūnų imunizacija
„Alpha Lifetech“ gali tiekti imunogenus klientams, o galite rinktis iš imuninių gyvūnų, tokių kaip pelės, triušiai, avys, alpakos, jūrų kiaulytės, žiurkėnai ir kt.

3. Monokloninių antikūnų gamybos metodai

●Monokloninių antikūnų gamyba naudojant hibridomos technologiją
Hibridoma yra hibridinė ląstelė, gaunama suliejus dviejų rūšių ląsteles, būtent pelių mielomos ląstelių liniją ir plazmos ląsteles (limfocitą B), kuriose heterozigotinė ląstelė gali nuolat gaminti antikūnus prieš dominantį antigeną in vitro. Hibridomos ląstelių linijos gamyba susideda iš trijų dalių: antigeno dizaino (haptenų, mažų molekulių ir peptidų), gyvūnų imunizacijos, ląstelių suliejimo ir teigiamo klono patikros. Naudodami unikalias imunizacijos metodikas, gauname išskirtinai didelį ląstelių suliejimo efektyvumą (1–10 hibridomų tūkstančiui B ląstelių) ir aukštus antikūnų titrus, maksimaliai padidindami mūsų sėkmės rodiklį vėlesniuose analitiniuose bandymuose, įskaitant biocheminį patikrinimą, in vitro ląstelių pagrindu atliekamus tyrimus ir tyrimus su gyvūnais.

●Monokloninių antikūnų gamyba naudojant fagų demonstravimo technologiją
Fagų demonstravimas siūlo dar vieną monokloninių antikūnų generavimo metodą. B limfocitai yra išskiriami iš gyvūnų kraujo ir išskiriama jų mRNR. PGR būdu ši mRNR paverčiama kDNR, kuri amplifikuoja visus VH ir VL segmentus. Šie segmentai tada klonuojami į vektorių, paprastai kaip vienos grandinės kintamieji fragmentai (scFv), kartu su bakteriofago PIII baltymu. Vėliau ši konstrukcija naudojama E. coli infekuoti, todėl, inokuliuojant pagalbiniu fagu, sukuriama maždaug 10^10 ląstelių biblioteka. Tada E. coli gali išskirti bakteriofagą, kurio apvalkalo dalyje yra VH ir VL segmentai. Po to galima atrinkti specifinius VH ir VL segmentus, nukreiptus į dominantį antigeną, ir panaudoti E. coli pakartotinei inokuliacijai bakteriofagu. Tada ląstelės, turinčios plazmidę, yra išskiriamos ir sekvenuojamos.

4. Sintezės patikra

●Ląstelių susiliejimas ir atranka
Surinktos B ląstelės suliejamos su mielomos ląstelėmis – vėžinėmis ląstelėmis, kurios kultūroje gali neribotą laiką daugintis. Suliejimas paprastai atliekamas naudojant tokią techniką kaip polietilenglikolio (PEG) suliejimas.
Po susiliejimo hibridomos ląstelės kultivuojamos selektyvioje terpėje, kuri leidžia išgyventi tik hibridomoms. Terpėje paprastai yra aminopterino, kuris neleidžia augti nesusiliejusioms mielomos ląstelėms.

●Atranka ir užsikimšimas
Gautos hibridomos ląstelės yra tikrinamos, ar nėra antikūnų, specifinių tiksliniam antigenui. Tai paprastai atliekama naudojant tokius metodus kaip imunofermentinis tyrimas (ELISA), Western blot, imunoprecipitacija ir srauto citometrija.

Kai antikūną gaminančios hibridomos ląstelės yra identifikuojamos, jos klonuojamos, kad būtų sukurta identiškų ląstelių populiacija. Tai užtikrina, kad kiekvienos hibridomos ląstelės gaminamas antikūnas yra identiškas.

5. Antikūnų funkcinis patikrinimas
„Alpha Lifetech“ teikia antikūnų funkcinio patvirtinimo paslaugas, tokias kaip Western blotavimas, imunohistochemija arba funkciniai tyrimai, siekiant apibūdinti monokloninius antikūnus ir patvirtinti antikūnų specifiškumą, afinitetą ir funkcionalumą.

6. Antikūnų optimizavimas
Antikūnų gryninimas iš kultūros supernatanto naudojant tokius metodus kaip baltymo A arba baltymo G afininė chromatografija, o „Alpha Lifetech“ taip pat gali pasiūlyti antikūnų modifikavimo metodus, skirtus pagerinti antikūnų afinitetą.

7. Antikūnų gamyba
„Alpha Lifetech“ gali įvertinti kandidatų antikūnus didelio našumo atrankos taikymams ir didelio masto gamybai.

DUKDUK

Monokloninių antikūnų kūrimo DUK

1

Kaip išsirinkti tinkamą susiliejusią hibridomą?

Suliejimo proceso metu 10–15 96 šulinėlių mikrotitravimo plokštelių pasėjamos suliejimo hibrido mišiniu. Kiekviena plokštelė maitinama HAT-IMDM atrankos terpe ir laikoma anglies dioksido inkubatoriuje 37 laipsnių Celsijaus temperatūroje. Praėjus 9–14 dienų po suliejimo, hibridų supernatantai tiriami dėl specifinių dominančių antikūnų buvimo.
2

Kaip pagerinti atrankos efektyvumą?

Plazminių ląstelių susiliejimas su mielomos atitikmenimis nėra 100 % efektyvus. Net ir optimaliomis sąlygomis bei veiksmingiausia stimuliacija, ląstelių susiliejimo metu vis tiek susidaro nesusiliejusių ir susiliejusių ląstelių mišinys, kurį reikia atskirti. Siekiant pagerinti atrankos proceso efektyvumą, susiliejimui naudojamose mielomos ląstelėse trūksta HGPRT – pagrindinio fermento nukleotidų gelbėjimo kelyje. Tada mišinys buvo kultivuojamas HAT terpėje, kurioje gyvybingos buvo tik ląstelės su HGPRT fermentu – hibridomos, paveldėjusios HGPRT iš plazminių ląstelių.
3

Kaip patikrinti hibridomos ląstelių linijas dėl antikūnų aktyvumo?

Hibridinių veislių įvertinimas yra labai svarbus žingsnis. Paprastai hibridomų, klonų ir subklonų supernatanto patikra atliekama naudojant imunofermentinį tyrimą (ELISA), Western blot tyrimą ir fluorescenciniu būdu aktyvuotą ląstelių rūšiavimą (FACS). Mes pasirinksime atlikti visą supernatanto patikrą savo laboratorijoje.
4

Pateikti išsamias instrukcijas, kaip atlikti antikūnų aktyvumo tyrimą?

Tiriamų hibridomų supernatatų kiekis gali svyruoti nuo 500 iki 1440 mėginių, ir jie bus paruošti tyrimui 9–14 dienomis. Tyrimai gali užtrukti nuo trijų iki penkių dienų arba visi mėginiai gali būti paruošti tą pačią dieną, todėl svarbu, kad kliento laboratorija būtų pasiruošusi iš anksto, pasirinkdama konkrečius antrinius atrankos tyrimus.
5

Kodėl teigiamas hibridomas reikia subklonuoti?

Nustačius teigiamus šulinėlius pradinės ELISA atrankos procedūros metu, hibridomos buvo perkeltos į didesnio tūrio, t. y. 24 šulinėlių plokšteles, ruošiantis subklonavimo procedūrai. Hibridomų subklonavimas paprastai atliekamas riboto skiedimo metodu, siekiant užtikrinti stabilių monoklonų išskyrimą. Šis metodas apima hibridomų kultūrų skiedimą ir dispergavimą į 96 šulinėlių plokšteles, siekiant monokloniškumo (po vieną ląstelę viename šulinėlyje). Siekiant sumažinti mišrių hibridomų populiacijų susidarymo riziką, reikėtų atlikti bent du ribotus skiedimus.
6

Kokie yra hibridomų technologijos naudojimo antikūnų atradimui privalumai?

Hibridinės ląstelių linijos buvo giriamos už jų gebėjimą gaminti didelio afiniteto, stabilumo ir specifiškumo antikūnus ekonomiškiausiu būdu.