Afinitātes mērīšanas platforma
Balstoties uz Octet un Biacore-T2000 platformu, Alpha Lifetech var nodrošināt uzticamus afinitātes noteikšanas pakalpojumus.
SAZINIETIES AR MUMS01
Afinitātes mērīšanas platforma
Balstoties uz Octet un Biacore-T2000 platformu, Alpha Lifetech var nodrošināt uzticamus afinitātes noteikšanas pakalpojumus. Mēs varam nodrošināt afinitātes noteikšanu vairākiem paraugiem, piemēram, antivielām, šūnām, olbaltumvielām, mazām molekulām utt. Ir dažādas afinitātes noteikšanas metodes, tostarp virsmas plazmonu rezonanses (SPR) un bioslāņu interferences (BLI) afinitātes noteikšana.
Uzņēmumam Alpha Lifetech ir profesionāla un precīza afinitātes noteikšanas platforma, kas apvieno ELISA ar afinitātes noteikšanu, nodrošinot profesionālus, efektīvus, ātrus un precīzus afinitātes noteikšanas rezultātus klientiem visā pasaulē. Mēs varam piedāvāt divas metodes, no kurām izvēlēties: ātro afinitātes noteikšanu un precīzu afinitātes noteikšanu. Ātrā afinitātes noteikšana ir vienas koncentrācijas noteikšana, savukārt precīzā afinitātes noteikšana var izmērīt dažādu koncentrāciju afinitāti. To piemēro mijiedarbības pētījumiem starp dažādiem mazmolekulāriem savienojumiem, peptīdiem, olbaltumvielām, oligonukleotīdiem un oligomēriem, kā arī lipīdiem, bakteriofāgiem, vīrusiem un šūnām. Afinitātes mērīšanas platforma var likt pamatu afinitātes zāļu testēšanai un skrīningam, antivielu atklāšanai un atvieglot turpmākos pētījumus.
Ievads saistīšanās afinitātē
Afinitāte ir svarīga starpmolekulāro mijiedarbību novērtēšanā, afinitātes zāļu testos un zāļu skrīningā. Starpmolekulārās mijiedarbības var aprakstīt ar vienādojumiem: L + R = LR, kur L apzīmē brīvos ligandus, R apzīmē nesaistītos receptorus un LR apzīmē saistītos ligandu-receptoru kompleksus. Saistīšanās reakcijas nosaka starpmolekulārās mijiedarbības, kurās reakcijas laikā notiek dinamiska apmaiņa starp saistīto un nesaistīto stāvokli, līdz tiek sasniegts līdzsvars. To var aprakstīt ar divām reakcijas ātruma konstantēm - Kon (saistīšanās ātruma konstante) un Koff (disociācijas ātruma konstante). Kd vērtība, kas ir saistīšanās konstantes (Ka) apgrieztā vērtība, ir Koff/Kon, svarīga reakcijas afinitātes konstante. Tāpēc, jo ciešāka ir saistība starp divām molekulām, jo lielāka ir afinitāte. Jo mazāka ir Kd vērtība, jo otrādi. Šo vienādojumu var attēlot kā S veida līkni puslogaritmiskā grafikā, kur ligandu koncentrācija ir uz x ass (uz logaritmiskās skalas ass) un daļskaitļu robeža - uz y ass. Pārtrauktā līnija attēlo ligandu koncentrāciju pie Kd (1 nM) 0,5 saistīšanās frakcijas.
1. attēls: Dažādu ligandu koncentrāciju sigmoidālā saistīšanās līkne, kas saistīta ar šūnas virsmas receptoru. (Atsauces avots: Hanters SA, Kokrans JR. Šūnu saistīšanās testi olbaltumvielu-olbaltumvielu mijiedarbības afinitātes noteikšanai: tehnoloģijas un apsvērumi.)
Afinitātes noteikšanas metodes
ELISA saistīšanās afinitātes tests
Plaši izmantotā antivielu afinitātes pētīšanas metode ir balstīta uz ELISA metodi, ko raksturo tās ērtības, ātrums, vienkāršība, augsta jutība un spēcīga specifiskums. Tā var izmantot nelielu daudzumu reaģentu (t. i., antivielas un antigēnus) un izmērīt antivielu afinitāti bez attīrīšanas reaģentu nepieciešamības. Imobilizējot antigēnu uz cietas virsmas un detektējot to, izmantojot primāro antivielu, iezīmētā sekundārā antiviela reaģē ar primāro antivielu, lai nolasītu un analizētu datus enzīmu saistītā imūnsorbcijas testa (ELISA) lasītājā.
2. attēls: ELISA līdzīgas analīzes, lai novērtētu izstrādāto peptīdu saistīšanos ar to mērķiem. (Atsauces avots: Hajikarimlou, Maryam u.c., 2022. Skaitļošanas pieeja, lai ātri izstrādātu peptīdus, kas nosaka SARS-CoV-2 virsmas proteīnu S.)
Virsmas plazmona rezonanses (SPR) saistīšanās afinitātes tests
SPR tehnoloģija galvenokārt nosaka refrakcijas indeksa izmaiņas. Izmantojot tradicionālās optiskās parādības un gaismas rezonanses fenomenu, var izveidot biosensoru analīzes tehnoloģiju biomolekulu mijiedarbībai, lai noteiktu ligandu un analītu mijiedarbību uz biosensoru mikroshēmām. Specifiskus biomolekulu saistīšanās un mijiedarbības signālus var iegūt, uzraugot SPR leņķu dinamiskās izmaiņas bioloģisko reakciju laikā.
3. attēls: H10/AGR2 saistīšanās virsmas plazmonu rezonanses (SPR) analīze. (Atsauces avots: Garri, Carolina u.c., 2018. Jauna peptīda pret priekšējā gradienta homologu 2 (AGR2) identificēšana, raksturojums un pielietojums.)
Bio slāņa interferences (BLI) saistīšanās afinitātes tests
Bioplēves interferences tehnoloģija ir bezmarķēšanas, reāllaika uzraudzības optiskās detekcijas metode, ko galvenokārt izmanto visaptverošai starpmolekulāro mijiedarbību kvantitatīvai analīzei un olbaltumvielu koncentrācijas noteikšanai. Šī tehnoloģija izmanto uz zondes balstītu biosensoru, lai tieši noteiktu bioplēves biezuma izmaiņas uz parauga. Nosakot interferences spektra nobīdes izmaiņas, tiek noteikta saistīšanās un disociācija starp biomolekulām, kas mijiedarbojas uz sensora virsmas, un tiek parādīts interferences spektra reāllaika nobīde (nm).
4. attēls: Bioslāņa interferometrijas (BLI) tests starp aLDRG un hitīnoligosaharīdiem. (Atsauces avots: Li, Bings, 2023. Salīdzinošā transkriptoma pazīmes starp Armillaria sp. 541 rizomorfiem un hifām, kas piedalās sēnīšu simbiozē ar uzsvaru uz LysM domēniem.)
BLI un SPR tehnoloģiju salīdzinājums
| Tehnoloģijas nosaukums | BLI (bioslāņu interferometrija) | SPR (virsmas plazmona rezonanse) |
|---|---|---|
| Princips | Mēra sensora virsmas atstarotās gaismas interferences modeļa izmaiņas, nosakot molekulārās mijiedarbības, izmantojot bioslāņa optiskā biezuma izmaiņas. Tas nodrošina reāllaika saistīšanās līkni (tiešs mērījums). | Mēra molekulāro mijiedarbību, nosakot signāla izmaiņas refrakcijas indeksā sensora mikroshēmas virsmas tuvumā (rodas, kad gaisma mijiedarbojas ar zelta un stikla saskarni, izraisot izmaiņas refrakcijas indeksā). Dati tiek atspoguļoti kā rezonanses leņķa izmaiņas (netiešais mērījums). |
| Ražotājs | Sartorius | Ģenerāldirektors |
| Instruments | ForteBio biosensori | Atvērts SPR instruments |
| Sistēma | ForteBio oktetu sistēma (molekulārās mijiedarbības analīzei) | TraceDrawer (izstrādātājs Ridgeview Instruments, Zviedrija) |
| Priekšrocības | 1. Plaša paraugu saderība, lieliska stabilitāte, īpaši mazu molekulu noteikšanai (īpašas prasības attiecībā uz parauga tīrību un bufera apstākļiem ir mazāk stingras). SSA mikroshēmas ir izmaksu ziņā efektīvas saistīšanās pētījumiem. 2. Ātrāka caurlaidspēja un īsāks eksperimenta laiks salīdzinājumā ar SPR. | 1. Ilgāka izstrādes vēsture, piedāvājot augstāku jutību salīdzinājumā ar BLI. 2. Lielāka precizitāte un robustums specifiskiem lietojumiem, piemēram, retu vai vērtīgu olbaltumvielu noteikšanai ar augstākiem afinitātes un specifiskuma datiem. |
| Trūkumi | 1. Datu precizitāte ir nedaudz zemāka salīdzinājumā ar SPR. 2. Nepieciešama rūpīga instrumenta apkope. 3. SSA mikroshēmas izmaksas ir salīdzinoši augstas. | 1. Buferšķīduma apstākļi ļoti mazu molekulu noteikšanai var būt sarežģīti, palielinot noteikšanas kļūmes risku. 2. Čipi parasti ir dārgāki nekā tie, ko izmanto BLI. 3. Parauga iztvaikošana ilgstošu eksperimentu laikā var radīt problēmas. |
| Čipa tips | SSA mikroshēma | NTA mikroshēma |
Afinitātes mērīšanas darbības joma
Afinitātes noteikšana var ietvert antigēna-antivielas (spēcīga antigēna-antiviela, vāja antigēna-antiviela), proteīna-proteīna, proteīna-peptīda, proteīna-mazas molekulas un proteīna DNS/RNS (aptamers) attiecības. Mērot KD, ir jāzina viena no molārajām koncentrācijām. Kad saistās mazas molekulas, vienas molekulmasas vērtība nedrīkst būt mazāka par 150 daltoniem.
| Tips | Darbības joma | Piesardzības pasākumi |
|---|---|---|
| 1. Antigēns-antiviela | no 10^-6 līdz 10^-12 | Vairumam antivielu Kd vērtības ir diapazonā no 10^-6-10^-7 līdz 10^-9. Parasti tiek uzskatīts, ka augstas afinitātes antivielas ir 10^-9 robežās, savukārt augstas afinitātes antivielas ir 10^-12 robežās. |
| 2. Olbaltumvielas - mazas molekulas | no 10^-4 līdz 10^-5 | Mazo molekulu un olbaltumvielu KD ir no 10^-4 līdz 10^-5, savukārt 10^-3 un 10^-7 ir normālas vērtības un nevar sasniegt 10^-10. Kovalentās mazās molekulas var sasniegt 10^-10. |
| 3. Avidīns-biotīns | 10^-14 | Afinitāte var viegli pakļauties nespecifiskai saistīšanai, un var izmantot streptavidīnu vai deglikozilētu afinitāti. |
| 4. DNS-olbaltumvielas | 10^-8 līdz 10^-10 | Augstas kvalitātes un pilnīga DNS; esiet uzmanīgi, lai novērstu elektroforēzes ietekmi. |
Parauga prasības afinitātes noteikšanai
| Paraugs | Prasības |
|---|---|
| 1. Liela molekulas parauga | Olbaltumvielas > 50 µg, antivielas > 100 µg, biotinilēts proteīns > 200 µg; olbaltumvielas bez biotīna > 2 mg, tīrības prasība > 90%, buferšķīdums: PBS, HEPBS. Nedrīkst saturēt imidazola grupas; nepieciešama kvalitātes kontrole. |
| 2. Maza molekulas paraugs | Daudzums > 1 mg, pulveris vai šķidrums, šķidrumam jābūt šķīstošam ūdenī vai DMSO. Centieties nesaturēt glicerīnu, imidazolu, trehalozi vai citus sāļus; centieties izvairīties no reaģentiem ar aminogrupām, piemēram, Tris buferšķīdumā, parasti PBS, HEPPS u.c. bez organiskiem reaģentiem. |
Vairāku paraugu analīze
Alpha Lifetech var nodrošināt afinitātes testus dažādiem paraugiem, tostarp antivielām, šūnām, olbaltumvielām un citām biomolekulām.
Nobriedusi tehnoloģiju platforma
Mums ir tādas progresīvas tehnoloģijas kā SPR saistīšanās tests, BLI saistīšanās tests un ELISA saistīšanās tests.
Elastīga projektu izvēle
Klienti var izvēlēties starp ātru afinitātes noteikšanu un precīzu afinitātes noteikšanu.
Augstas precizitātes rezultāti
Mūsu profesionālā tehniskā komanda var nodrošināt efektīvus, precīzus un uzticamus afinitātes noteikšanas rezultātus.
Gadījuma izpēteLIETU
BLI ātrās afinitātes testa antivielu un aptameru afinitātes tests
Uztveriet biotinilētus aptamērus ar SA zondes specifiskumu un izšķīdiniet tos. Izšķīdiniet un atšķaidiet paraugu līdz fiksētai koncentrācijai, sacietējiet zondei specifiskos uztvertos Target 1-5 aptamērus un pēc signāla piesātinājuma saistieties ar paraugu. Pēc tam pievienojiet tos 96 iedobju plāksnei.
5. attēls: Detekcijas pozīciju sadalījums 96 iedobju plāksnes paraugiem. B apzīmē buferi, ko izmanto sensoru balansēšanai un disociācijai. L: Biotīna mērķa 1-5 aptamēri, 221: Paraugs.
Pievērsiet uzmanību urbšanai, lai nodrošinātu datu stabilitāti un precizitāti, un iestatiet atbilstošo programmu rezultātu iegūšanai:
6. attēls: Mijiedarbības atbilstības diagramma starp 1., 2. un 3. mērķa aptamēriem un paraugiem. (CH1 \3 \5 apzīmē sacietējušā 1. \2 \3. mērķa aptamēru zondes un parauga mijiedarbības signālu un datus.)
7. attēls: Mijiedarbības atbilstības diagramma starp Target 4 un 5 aptamēriem un paraugiem. (CH1 \ 3 apzīmē mijiedarbības signālu un datus starp sacietējušo Target 4 \ 5 aptamera zondi un paraugu.)
rezultāti rāda
Tika iegūti šādi rezultāti: Target 1 adaptera afinitāte pret paraugu pēc pielāgošanas bija 9,41 ^ -8; Target 2 adaptera afinitāte pret paraugu pēc pielāgošanas ir 8,32 ^ -8; Target 3 adaptera afinitāte pret paraugu pēc pielāgošanas ir 8,64 ^ -8; Target 4 adaptera afinitāte pret paraugu pēc pielāgošanas ir 3,70 ^ -8; Target 5 adaptera afinitāte pret paraugu pēc pielāgošanas ir 3,01 ^ -8.
Ja jums ir kādi jautājumi, lūdzu, sazinieties ar mums jebkurā laikā.
Leave Your Message
2018-07-16 
0102