Fāgu displeja tehnoloģija ietver svešā mērķa gēna ievietošanu fāga kapsīda proteīna specifiskajā pozīcijā un svešā gēna ekspresēšanu uz fāga virsmas, neietekmējot fāga normālo funkciju. Pēc vairākām skrīninga kārtām beidzot tiek iegūts mērķa proteīns ar spēcīgu specifiskumu un augstu bioloģisko aktivitāti.

Izmantojot šo tehnoloģiju, var ģenerēt lielas ietilpības antivielu bibliotēkas. Skrīninga cikls ir īss, darbības process ir vienkāršs, un pielietojumu klāsts ir plašs, ļaujot identificēt optimālas sekvences mērķa peptīdiem vai olbaltumvielām. Ar vīrusiem saistītos pielietojumos pētnieki var atklāt antivielas, kas saistās ar kritiskiem vīrusu epitopiem, skrīninga ceļā pārbaudot lielas antivielu bibliotēkas. Šis process var kavēt vīrusu iekļūšanas, replikācijas vai imūnsistēmas apiešanas mehānismus, tādējādi izveidojot pamatu slimību ārstēšanai.

Fāgu displeja tehnoloģija tiek plaši izmantota nekā hibridomu tehnoloģija, kas aprobežojas ar neliela daudzuma antivielu ražošanu pret specifiskiem imunogēniem. Turpretī fāgu displeja tehnoloģija var prezentēt visu antivielu bibliotēku, kas iegūta no dažādām imūnsistēmas sugām.

Fāgu displeja tehnoloģijai ir plašs pielietojumu klāsts, tostarp patogēno mikroorganismu receptoru skrīnings, olbaltumvielu mijiedarbības izpēte, signālu pārraides izsekošana starp šūnām, dzīvnieku slimību diagnosticēšana un vakcīnu izstrāde, kā arī citas jomas.

Fāgu displeja tehnoloģija piedāvā daudzas priekšrocības un to var pielietot dažādās jomās. Tomēr galvenais izaicinājums rekombinanto antivielu izstrādē, izmantojot fāgu displeja metodi, ir ar procesu saistītās sarežģītības un izmaksas. Šī pieeja prasa integrēt molekulārās bioloģijas metodes, tostarp mutāciju, klonēšanu un ekspresiju, kā arī imunoloģiskas, bioķīmiskas un biofiziskas analīzes, lai identificētu un raksturotu vēlamās antivielas.

Antigēnu prezentācija ir ļoti svarīga saikne. Antigēnu prezentācijas metodes galvenokārt ietver tiešu pārklātu antigēnu prezentāciju, netiešu pārklātu antigēnu prezentāciju, antigēnu prezentāciju, izmantojot veselu šūnu skrīningu, antigēnu prezentāciju, izmantojot liposomas, nanofosfolipīdu diskus un VLP.

Tiešās pārklāšanas metode ir relatīvi vienkārša, taču antigēna konformāciju ir viegli mainīt, un netiešās pārklāšanas operācija ir sarežģīta, taču tā var saglabāt antigēna konformāciju un uzlabot prezentācijas efektivitāti. Šūnu skrīnings var simulēt reālo ainu in vivo, taču pastāv nespecifiskas saistīšanās problēma. Nanofosfolipīdu diskam ir mazs izmērs, augsta piegādes efektivitāte un laba stabilitāte; VLP ir sapludināti ar antigēnu vai ietīti ar antigēnu, kam ir augsta imunogenitāte un laba drošība, un tie var izraisīt spēcīgu imūnreakciju.

Ja koncentrācija ir pārāk zema, saistīšanās ar fāgu varbūtība samazināsies, kā rezultātā samazināsies skrīninga efektivitāte. Turpretī pārmērīgi augsta koncentrācija var palielināt nespecifiskas saistīšanās varbūtību, paaugstināt fona signālu un kavēt pozitīvu klonu identificēšanu.

Lai izvairītos no augstas temperatūras, stiprām skābēm un sārmiem, var izmantot maigu fiksācijas metodi. Lai samazinātu antigēna struktūras bojājumus, tika izmantota netiešā pārklāšanas metode un biotīna-streptavidīna sistēma. Ja antigēns ir membrānas proteīns, to var attēlot uz veselu šūnu virsmas vai izmantot membrānas vides simulēšanai, piemēram, nanodisku, lai saglabātu tā dabisko membrānas proteīna konformāciju.

Papildus tādiem rutīnas eksperimentiem kā ELISA, Western blotēšana (WB) un imunofluorescence (IF), virsmas plazmona rezonanses (SPR) un bioslāņu interferometrijas (BLI) noteikšanas metodes var izmantot, lai reāllaikā uzraudzītu antivielu un antigēnu saistīšanās un disociācijas procesus, ļaujot noteikt afinitātes un kinētiskos parametrus.

Fāgu displeju var izmantot, lai ģenerētu augstas afinitātes monoklonālās antivielas plašam antivielas producējošo sugu klāstam, tostarp, bet ne tikai, cilvēkiem, pelēm, žurkām, trušiem, vistām, kamieļiem, alpākām, govīm, suņiem, aitām, pērtiķiem un haizivīm.

Peļu antivielu bibliotēku veidošanas tehnoloģija ir labi izveidota, rentabla un tai ir īss eksperimentālais ilgums, padarot to piemērotu antivielu sākotnējai skrīningam un pamatpētījumiem. Trušu antivielām ir spēcīga afinitāte un specifiskums, ar plašāku epitopu atpazīšanas diapazonu salīdzinājumā ar peļu antivielām. Cilvēka antivielas var iegūt tieši no cilvēka antivielu bibliotēkām, tādējādi izvairoties no iespējamām imūnreakcijām, kas var rasties, ja cilvēka organismā tiek ievadītas heterologas antivielas. Šai pieejai ir būtiska vērtība zāļu pētniecībā un attīstībā, jo īpaši terapeitisko antivielu izveidē.

Dzīvnieku imunogēnus parasti iedala olbaltumvielu antigēnos, polipeptīdu antigēnos, nukleīnskābju antigēnos un ar patogēnu saistītos antigēnos, starp kuriem ar patogēnu saistītajiem antigēniem ietilpst vīrusa antigēni (pilnīga vīrusa daļiņa, vīrusa proteīns, vīrusa nestrukturālais proteīns utt.), baktēriju antigēni (pilnīgs baktēriju ekstrakts, šūnas sienas komponents, sekrētais proteīns, toksīns utt.) un parazīta antigēni.

Pielāgojiet imunogēnus, aizstājot imūnās antigēnas ar rekombinantiem proteīniem un aizstājot ugunsdzēsības vīrusu daļiņas ar vīrusu strukturālajiem proteīniem. Pielāgojiet eksperimenta dizainu un modificējiet imūnās devas.

Imunogenitāti var uzlabot, savienojot antigēnus ar nesējproteīniem, piemēram, liellopu seruma albumīnu. Turklāt imūnadjuvantus, tostarp Freunda adjuvantu un alumīnija adjuvantu, var izmantot, lai pagarinātu uzturēšanās laiku in vivo un stimulētu imūnšūnu aktivāciju un proliferāciju, tādējādi uzlabojot imunogenitāti.

Fāgu antivielu bibliotēka ir dažādu fāgu antivielu kolekcija, kas izveidota, saliekot pilnu mainīgo reģionu gēnu komplektu no antivielām fāgu vektoros un ekspresējot tos uz fāgu virsmām. Šī procesa rezultātā veidojas fāgu antivielu bibliotēka.

Fāgu displeja vispārējais process ietver vairākus galvenos soļus: perifēro asiņu mononukleāro šūnu (PBMC) ekstrakciju no imunizētiem dzīvniekiem, kopējās RNS izolēšanu un tās transkripciju komplementārā DNS (cDNS), mērķa gēna amplifikāciju, izmantojot polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) tehnoloģiju, mērķa gēna klonēšanu fāgu vektorā un vektora transformēšanu saimniekšūnā ekspresijai. Šī procesa rezultātā tiek izveidota fāgu displeja bibliotēka, kas var ātri identificēt augstas afinitātes antivielas. Pēc tam šī bibliotēka var kalpot kā vērtīgs resurss vakcīnu, terapeitisko zāļu un diagnostisko reaģentu izstrādei.

Atkarībā no antivielu bibliotēkas avota fāgu antivielu bibliotēkas var iedalīt imūno fāgu antivielu bibliotēkās un dabisko fāgu antivielu bibliotēkās. Galvenā atšķirība starp šiem diviem veidiem ir tā, vai dzīvnieki ir vakcinēti. Turklāt dabiskās antivielu bibliotēkas var ģenerēt, izmantojot daļēju sintēzi vai sintēzi.

Antivielu bibliotēkas kvalitātes novērtēšanai ir divi galvenie rādītāji: uzglabāšanas ietilpība un daudzveidība. Liela uzglabāšanas ietilpība apvienojumā ar augstu daudzveidību nodrošina efektīvu antivielu skrīningu gan ar augstu afinitāti, gan specifiskumu.

Bioloģiskās elutrācijas procesā displeja bibliotēka tiek inkubēta ar fiksētiem mērķiem un pēc tam plaši mazgāta, lai noņemtu nereaģējošos fāgus. Konjugātus parasti eluē, izmantojot skābu vai augsta sāls satura šķīdumu, un pēc tam amplificē piemērotās saimniekšūnās bagātināšanai. Pēc 3 līdz 5 skrīninga kārtām tiek iegūtas antivielas ar augstu afinitāti.

Fāgu skrīninga metodes galvenokārt ietver cietfāzes panoramēšanu, šķidrfāzes skrīningu un uz šūnām balstītu skrīningu. Izvēloties piemērotu skrīninga metodi, jāņem vērā mērķa molekulu īpašības, skrīninga procesa mērķi un laboratorijas vide.

Pozitīvā skrīnings ir visfundamentālākā metode fāgu antivielu, kas saistās ar mērķa proteīniem, skrīningam. Negatīvā skrīnings kalpo nespecifisku antivielu eliminēšanai. Fāgu antivielu skrīninga procesā nespecifiskas antivielas var tikt identificētas mērķa antigēna marķējuma, materiālu vai citu antigēnu, kam ir strukturālas līdzības ar mērķa antigēnu, radīto traucējumu dēļ. Šādos gadījumos negatīva skrīnings var uzlabot skrīninga procesa efektivitāti.

Antivielu verifikācijas metodes parasti ietver ELISA, Western blotēšanu (WB), plūsmas citometriju, imunoprecipitāciju (IP), imunofluorescenci (IF), imūnhistoķīmiju un dažādas citas eksperimentālas metodes. Uzņēmumam Alpha Lifetech ir plaša pieredze antivielu noteikšanā un profesionāla eksperimentālā komanda, kas nodrošina antivielu efektivitāti turpmākajos eksperimentos.