Aptamer pētniecības dienests

Ievads Aptamerā

Aptamēri ir vienpavedienu nukleīnskābju (piemēram, DNS vai RNS) molekulas, kas tiek in vitro skrīningotas no sintētisku oligonukleotīdu bibliotēkas ar nejauši piešķirtām sekvencēm, izmantojot procesu, ko sauc par SELEX skrīningu, kas ietver vairākas iteratīvas atlases kārtas. Alpha Lifetech piederošo aptameru izstrādes pakalpojumu galvenās sastāvdaļas ir aptameru bibliotēkas veidošana, aptameru SELEX skrīnings, aptameru SELEX sekvencēšana, aptameru sekvenču analīze un cita aptameru analīze.

SELEX sekvencēšana apvieno aptameru SELEX skrīningu un augstas caurlaidības sekvencēšanu. Ar aptameru SELEX sekvencēšanas palīdzību var efektīvi noteikt ar mērķi saistītā aptamera specifisko secību, nodrošinot pamatdatus turpmākai aptameru secības analīzei un pielietojumam.

Aptamēri ir plaši izmantoti zinātniskajos pētījumos, slimību ārstēšanā, biosensoru izstrādē, zāļu atklāšanā un vides monitoringā. Tomēr in vitro pārbaudītie oligonukleotīdu aptamēri in vivo viegli noārdījās un pat uzrādīja toksicitāti. Tāpēc pēc pārbaudīto aptamēru optimizācijas ir nepieciešama in vitro analīze, lai novērtētu aptameru izstrādes panākumus. Atbilstoši klientu dažādajām analīzes vajadzībām Alpha Lifetech piedāvā dažādas aptameru analīzes stratēģijas, no kurām izvēlēties.

1. att. Aptameru analīzes diagramma. Atsauces avots:Thevendran R, Citartan M. 2022. Aptamēru saistīšanās afinitātes novērtēšanas testi.

Ievads Aptameru pētniecības pakalpojumā

Aptameru stabilitātes analīze

Nukleāzes degradācijas eksperiments

Inkubējot aptameru ar dažāda veida nukleāzēm (piemēram, DNāzi, RNāzi utt.) noteiktos apstākļos, tiek novērota aptamera degradācija, lai novērtētu tā spēju pret degradāciju. Tas ir noderīgi, lai noteiktu aptamera stabilitāti un izturību praktiskos pielietojumos.

Fluorescējošas marķēšanas metode

Aptamera stabilitāti novērtē netieši, marķējot fluoroforus uz aptamera un novērojot fluorescences signāla izmaiņas pirms un pēc saistīšanās ar mērķi. Piemēram, kad aptamers saistās ar mērķi, tā konformācija var mainīties, kā rezultātā fluorescences signāls var pastiprināties vai samazināties.

Termiskās stabilitātes analīze

Aptamera termisko stabilitāti novērtē, mērot tā kušanas temperatūras (Tm vērtības) izmaiņas dažādās temperatūrās. Jo augstāka ir aptamera kušanas temperatūra, jo labāka tā termiskā stabilitāte.

Dinamiskās stabilitātes analīze

Virsmas plazmonu rezonanse (SPR) un citas tehnoloģijas tika izmantotas, lai reāllaikā uzraudzītu aptamera un mērķa saistīšanās un atdalīšanās procesu, iegūtu dinamiskos parametrus (piemēram, saistīšanās ātruma konstanti, disociācijas ātruma konstanti utt.), labāk izprastu aptamera un mērķa mijiedarbības mehānismu un novērtētu tā dinamisko stabilitāti.

Konstrukcijas stabilitātes analīze

Aptamera trīsdimensiju struktūras un tās strukturālās stabilitātes analīzei tika izmantotas rentgenstaru kristalogrāfija, kodolmagnētiskās rezonanses (NMR) un citas strukturālās bioloģijas metodes.

Aptameru specifiskā analīze

Aptameru saistīšanās tests

Afinitāti novērtē, veicot aptameru saistīšanās testu, lai izmērītu saistīšanās konstanti starp aptameru un mērķa molekulu, piemēram, disociācijas konstanti Kd. Zemāka Kd vērtība norāda uz augstāku afinitāti. Aptameru saistīšanās tests var atsijāt zāļu kandidātus ar augstu saistīšanās spēju un pēc tam veikt turpmākus farmakodinamikas un farmakokinētikas pētījumus.

Reversās skrīninga eksperiments

Reversās skrīninga tests ir skrīninga metode, lai ātri izslēgtu nemērķa molekulas no liela skaita kandidātu molekulu. Reversā skrīninga mērķis ir izslēgt molekulas, kurām nepiemīt šī īpašība vai funkcija. Reversās skrīninga atslēga ir atbilstošu reversās skrīninga marķieru vai apstākļu izvēle, kas ļauj skrīninga procesa laikā identificēt un noņemt nemērķa molekulas. Šajā eksperimentā nemērķa molekulu atlase ir ļoti svarīga. Jānodrošina, lai atlasītās nemērķa molekulas pārstāvētu vielas, kas var traucēt aptameru skrīningu, un lai iespējamie traucējošie faktori tiktu aptverti pēc iespējas pilnīgāk.

Konkurences inhibīcijas eksperiments

Pievienojot aptamera un mērķa molekulas saistīšanās sistēmai pārmērīgu konkurentu daudzumu (piemēram, molekulas ar līdzīgu struktūru kā mērķa molekulai), tiek novērotas aptamera un mērķa molekulas saistīšanās spējas izmaiņas. Ja aptamera spēja saistīties ar mērķa molekulu ir ievērojami samazināta, tas norāda, ka aptameram ir augsta specifiskums.

Dažos gadījumos konkurējošas inhibīcijas eksperimentus var izmantot kā daļu no reversās skrīninga eksperimentiem vai kā papildinājumu tiem. Piemēram, zāļu skrīninga procesā zāļu molekulas spēju saistīties ar mērķa proteīnu var novērtēt, izmantojot konkurējošas inhibīcijas eksperimentus, un pēc tam reversās skrīninga eksperimentus var izmantot, lai noņemtu tos savienojumus, kas ir pārāk stipri saistīti ar normālām šūnām vai audiem.

Aptameru citotoksicitātes analīze

Aptameru citotoksicitātes analīzei ir dažādas eksperimentālas metodes, kas paredzētas, lai novērtētu aptameru ietekmi uz šūnu izdzīvošanu, proliferāciju vai funkciju.

Metodes	Detalizēts ievads	Priekšrocība	Trūkums
MTT noteikšanas metode	MTT tests ir metode, kuras pamatā ir enzīmu aktivitāte dzīvo šūnu mitohondrijos. Dzīvo šūnu mitohondrijos esošā sukcināta dehidrogenāze var reducēt eksogēno MTT līdz ūdenī nešķīstošam zili violetam kristālam Formazānam un nogulsnēt to šūnā, savukārt mirušajām šūnām šāda funkcija nav. Šo kristālu šķīdināšana dimetilsulfoksīdā (DMSO) un absorbcijas noteikšana noteiktos viļņu garumos (piemēram, 490 nm vai 570 nm) uz fermentu ģeneratora var netieši atspoguļot dzīvo šūnu skaitu un tādējādi novērtēt aptamera citotoksicitāti.	Augsta jutība, ekonomija un ērtības	Liela darba slodze, organiskie šķīdinātāji var sabojāt šūnas; var iegūt tikai galīgos eksperimentālos rezultātus, un pilnīgu citotoksicitātes procesu nevar apskatīt.
CCK-8 noteikšanas metode	Šūnu skaitīšanas komplekts-8 (CCK-8) ir augstas jutības, neradioaktīva kolorimetriska noteikšanas metode. CCK-8 satur WST-8, ko dzīvo šūnu mitohondrijos dehidrogenāze reducē, veidojot ūdenī ļoti šķīstošu oranžu metilzāna degvielu. Saražotās mezāna krāsvielas daudzums ir lineāri proporcionāls dzīvo šūnu skaitam, un dzīvo šūnu skaitu var netieši atspoguļot, mērot mezāna krāsvielas gaismas absorbcijas vērtību 450 nm viļņa garumā, lai novērtētu aptamera citotoksicitāti.	Vienkārša darbība, nav nepieciešams mazgāt šūnas, ātra noteikšana, plašs lineārs noteikšanas diapazons, augsta jutība, laba atkārtojamība, neliela citotoksicitāte	Augsta reaģenta cena; dažreiz ir grūti pateikt, vai samazinātā absorbcija ir saistīta ar dzīvo šūnu skaita samazināšanos vai pašas šūnu dehidrogenāzes aktivitātes samazināšanos.
LDH noteikšanas metode	LDH (laktātdehidrogenāze) ir enzīms, kas ir stabils šūnu citoplazmā, un, ja šūnas membrāna ir bojāta, LDH tiek atbrīvots ārpus šūnas. LDH var katalizēt pienskābi, veidojot piruvātu, un reaģēt ar INT (tetrazolija sāļiem), veidojot violetu kristālisku vielu. Mērot tā absorbciju noteiktā viļņa garumā (piemēram, 490 nm), var atspoguļot šūnu bojājuma pakāpi un pēc tam novērtēt aptamera citotoksicitāti.	Tas tieši atspoguļo šūnu mirstības līmeni, un tam ir mazāks šūnu bojājums, un nav radioaktīvo izotopu piesārņojuma.	Nepieciešamība bieži izņemt šūnas no inkubatora, darbība ir sarežģītāka; Var iegūt tikai galīgos eksperimentālos rezultātus, un pilnīgu citotoksicitātes procesu nevar apskatīt.
Reāllaika dzīvu šūnu attēlveidošanas analīze	Izmantojot reāllaika dzīvu šūnu attēlveidošanas analizatoru, instruments tika ievietots inkubatorā, lai reāllaikā novērotu un reģistrētu visu šūnu augšanas cikla procesu. Aptamēru citotoksicitāti var novērtēt, analizējot šūnu morfoloģiskās izmaiņas un augšanas līknes. Šī metode var nodrošināt video un kvantitatīvus citotoksisko procesu rezultātus, vienlaikus saglabājot stabilu šūnu augšanas vidi.	Tas var uzraudzīt citotoksisko procesu reāllaikā, izmantojot nesagraujošu attēlveidošanu, samazināt traucējumus un šūnu bojājumus; Padziļinātai analīzei ir pieejami gan video, gan kvantitatīvi rezultāti.	Iekārtu izmaksas ir augstas, un tām ir nepieciešamas profesionālas ekspluatācijas prasmes un datu analīzes spējas.

KACHI

Aptamer pētniecības pakalpojuma priekšrocība

Pilnīga kvalitātes kontrole

Optimizēti aptameri ar augstāku stabilitāti

Ekonomisks un efektīvs. Konkurētspējīgāka cena, labāks serviss.

Visaptverošas pētījumu vietnes un vairākas pētījumu metodes

Profesionālas pirmspārdošanas konsultācijas un pēcpārdošanas atbalsta pakalpojumi

Bagāta pieredze aptameru analīzē

Augsta līmeņa pētniecības un attīstības komanda

Pielāgoti ar aptameriem saistīti pakalpojumi

Atgriezties Aptamer izstrādes platformas lapā

Ja jums ir kādi jautājumi, lūdzu, sazinieties ar mums jebkurā laikā.

Leave Your Message

Piedāvātais pakalpojums

0102