Monoklonālo antivielu izstrādes pakalpojums

Alpha Lifetech Inc.var nodrošināt epitopu prognozēšanu, peptīdu sintēzi, olbaltumvielu ekspresiju, poliklonālu vai monoklonālu antivielu ražošanu, kā arī antivielu attīrīšanu no šūnu kultūras, ascīta šķidruma vai visa seruma.

Alpha Lifetech Inc.ir pieredze dažādu stabilu šūnu līniju pakalpojumu sniegšanā klientiem, tostarp hibridomas šūnām, genoma rediģēšanas šūnu līnijām, knockdown šūnu līnijām un pārmērīgas ekspresijas šūnu līnijām. Mēs cenšamies piedāvāt uzlabotus, pielāgotus šūnu līniju pakalpojumus katram klientam, un mūsu pakalpojumi ir pārbaudīti un uzticami.

Antivielu attīstības stratēģija

1. Antigēnu dizains un sagatavošana
Šie antigēni var būt olbaltumvielas, peptīdi vai citas molekulas. Imunogēnu izstrādei nepieciešama visaptveroša pieeja, kas apvieno zināšanas par antigēnu struktūru, imunoloģiju un piegādes sistēmām. Alpha Lifetech piedāvā antigēnu izstrādes tehnoloģiju, kas var izstrādāt imunogēnus klientiem, kuriem tie nepieciešami.
Alpha Lifetech piedāvā rekombinanto olbaltumvielu produktus, no kuriem klienti var izvēlēties. Mums ir dažādas olbaltumvielu ekspresijas sistēmas, piemēram, E. coli ekspresijas sistēma, rauga ekspresijas sistēma, bakulovīrusa-kukaiņu ekspresijas sistēma, zīdītāju ekspresijas sistēma utt., lai ražotu pētniecībai nepieciešamos rekombinanto olbaltumvielu produktus.

2. Dzīvnieku imunizācija
Alpha Lifetech var nodrošināt klientus ar imunogēniem, un Jums ir pieejami imūni dzīvnieki, piemēram, peles, truši, aitas, alpakas, jūrascūciņas, kāmji utt.

3. Monoklonālo antivielu ražošanas metodes

●Monoklonālo antivielu (MAB) ražošana, izmantojot hibridomas tehnoloģiju
Hibridoma ir hibrīdšūna, kas rodas, saplūstot divu veidu šūnām, proti, peļu mielomas šūnu līnijai un plazmas šūnām (limfocītu B), kurās heterozigotā šūna in vitro var nepārtraukti ražot antivielas pret interesējošo antigēnu. Hibridomas šūnu līnijas iegūšana sastāv no trim daļām: antigēna dizaina (haptēni, mazas molekulas un peptīdi), dzīvnieku imunizācijas, šūnu saplūšanas un pozitīvu klonu skrīninga. Izmantojot unikālas imunizācijas metodoloģijas, mēs iegūstam ārkārtīgi augstu šūnu saplūšanas efektivitāti (1–10 hibridomas uz tūkstoš B šūnām) un augstus antivielu titrus, maksimāli palielinot mūsu panākumu līmeni turpmākajos analītiskajos testos, kas ietver bioķīmisko skrīningu, in vitro šūnu testus un pētījumus ar dzīvniekiem.

●Monoklonālo antivielu (MAB) ražošana, izmantojot fāgu displeja tehnoloģiju
Fāgu displejs piedāvā vēl vienu metodi monoklonālo antivielu ģenerēšanai. B limfocīti tiek izolēti no dzīvnieku asinīm, un to mRNS tiek ekstrahēta. Ar PCR palīdzību šī mRNS tiek pārveidota par kDNS, kas amplificē visus VH un VL segmentus. Pēc tam šie segmenti tiek klonēti vektorā, parasti kā vienas ķēdes mainīgie fragmenti (scFv), kopā ar bakteriofāga PIII proteīnu. Pēc tam šo konstrukciju izmanto, lai inficētu E. coli, kā rezultātā, inokulējot ar palīgfāgu, tiek izveidota bibliotēka, kas satur aptuveni 10^10 šūnas. Pēc tam E. coli spēj izdalīt bakteriofāgu, kas satur VH un VL segmentus kā daļu no sava apvalka. Pēc tam var atlasīt specifiskus VH un VL segmentus, kas vērsti pret interesējošo antigēnu, un izmantot, lai atkārtoti inokulētu E. coli ar bakteriofāgu. Pēc tam šūnas, kas satur plazmīdu, tiek izolētas un sekvencētas.

4. Saplūšanas skrīnings

●Šūnu saplūšana un atlase
Iegūtās B šūnas pēc tam tiek sapludinātas ar mielomas šūnām, kas ir vēža šūnas, kuras kultūrā var neierobežoti vairoties. Sapludināšana parasti tiek panākta, izmantojot tādu metodi kā polietilēnglikola (PEG) sapludināšana.
Pēc saplūšanas hibridomas šūnas tiek kultivētas selektīvā vidē, kas ļauj izdzīvot tikai hibridomām. Vide parasti satur aminopterīnu, kas novērš nesapludinātu mielomas šūnu augšanu.

●Skrīnings un klonēšana
Iegūtās hibridomas šūnas tiek pārbaudītas, lai noteiktu mērķa antigēnam specifisku antivielu veidošanos. To parasti veic, izmantojot tādas metodes kā ar enzīmiem saistīta imūnsorbcijas analīze (ELISA), Western blot, imunoprecipitācija un plūsmas citometrija.

Kad ir identificētas hibridomas šūnas, kas producē antivielas, tās tiek klonētas, lai izveidotu identisku šūnu populāciju. Tas nodrošina, ka katras hibridomas šūnas producētās antivielas ir identiskas.

5.Antivielu funkcionālā pārbaude
Alpha Lifetech nodrošina antivielu funkcionālo validāciju, piemēram, Western blotēšanu, imūnhistoķīmiju vai funkcionālās analīzes, lai raksturotu monoklonālās antivielas un apstiprinātu antivielu specifiskumu, afinitāti un funkcionalitāti.

6.Antivielu optimizācija
Antivielu attīrīšana no kultūras supernatāta, izmantojot tādas metodes kā A proteīna vai G proteīna afinitātes hromatogrāfiju, un Alpha Lifetech var nodrošināt arī antivielu modifikācijas metodes, lai uzlabotu antivielu afinitāti.

7.Antivielu ražošana
Alpha Lifetech var novērtēt kandidātu antivielas augstas caurlaidības skrīninga lietojumprogrammām un liela mēroga ražošanai.

bieži uzdotie jautājumibieži uzdotie jautājumi

Bieži uzdotie jautājumi par monoklonālo antivielu izstrādi

1

Kā izvēlēties pareizo saplūšanas hibridomu?

Saplūšanas procesa laikā 10–15 96 iedobju mikrotitrēšanas plāksnes tiek apsētas ar saplūšanas hibrīda maisījumu. Katra plāksne tiek barota ar HAT-IMDM atlases barotni un turēta oglekļa dioksīda inkubatorā 37 grādu pēc Celsija temperatūrā. 9–14 dienas pēc saplūšanas hibrīda supernatanti tiek pārbaudīti, lai noteiktu specifisko interesējošo antivielu klātbūtni.
2

Kā uzlabot atlases efektivitāti?

Plazmas šūnu saplūšana ar mielomas analogiem nav 100% efektīva. Pat optimālos apstākļos un ar visefektīvāko stimulāciju šūnu saplūšana joprojām rada nesavienotu un saplūdušu šūnu maisījumu, kas ir jāatdala. Lai uzlabotu atlases procesa efektivitāti, saplūšanai izmantotajām mielomas šūnām trūkst HGPRT, kas ir galvenais enzīms nukleotīdu glābšanas ceļā. Pēc tam maisījums tika kultivēts HAT vidē, kur dzīvotspējīgas bija tikai šūnas ar HGPRT enzīmu, hibridomas, kas mantoja HGPRT no plazmas šūnām.
3

Kā pārbaudīt hibridomas šūnu līnijas antivielu aktivitātes noteikšanai?

Hibrīdu šķirņu novērtēšana ir izšķirošs solis. Parasti hibridomu, klonu un subklonu supernatanta skrīningu nodrošina, izmantojot ar enzīmu saistītu imūnsorbcijas testu (ELISA), Western blot testu un fluorescences aktivētu šūnu šķirošanu (FACS). Mēs izvēlēsimies visu supernatanta skrīningu veikt savā laboratorijā.
4

Sniegt detalizētus norādījumus par antivielu aktivitātes skrīninga veikšanu?

Testējamo hibridomas supernātu daudzums var būt no 500 līdz 1440 paraugiem, un tie būs gatavi testēšanai 9.–14. dienā. Testēšana var notikt trīs līdz piecu dienu laikā vai arī visi paraugi var būt gatavi vienā dienā, tāpēc ir svarīgi, lai klienta laboratorija būtu sagatavota vairākas nedēļas iepriekš ar izvēlētajām specifiskajām sekundārajām skrīninga analīzēm.
5

Kāpēc pozitīvas hibridomas ir jāklonē?

Pēc tam, kad sākotnējās ELISA skrīninga procedūras laikā tika identificētas pozitīvas iedobes, hibridomas tika pārvietotas uz lielāka tilpuma, t.i., 24 iedobju plāksnēm, lai sagatavotos subklonēšanas procedūrai. Hibridomu subklonēšana parasti tiek veikta ar ierobežotas atšķaidīšanas metodi, lai nodrošinātu stabilu monoklonālu izolāciju. Šī metode ietver hibridomu kultūru atšķaidīšanu un izkliedēšanu 96 iedobju plāksnēs, lai panāktu monoklonalitāti (viena šūna katrā iedobē). Lai samazinātu jauktu hibridomu populāciju attīstības risku, jāveic vismaz divas ierobežotas atšķaidīšanas.
6

Kādas ir hibridomas tehnoloģijas izmantošanas priekšrocības antivielu atklāšanā?

Hibrīda šūnu līnijas ir slavētas par spēju ražot antivielas ar augstu afinitāti, stabilitāti un specifiskumu visrentablākajā veidā.