Fāgu displeja bibliotēkas skrīninga pakalpojums

Alpha Lifetech jau daudzus gadus ir dziļi iesaistījies fāgu displeja tehnoloģijā. Tas ir izveidojis perfektu, stabilu fāgu displeja tehnoloģijas platformu, kas ietaupa laiku zinātniskajiem pētījumiem vai projektu pētījumiem un atvieglo turpmāko ražošanu. Alpha Lifetech var sniegt klientiem arī tādus pakalpojumus kā vhh antivielu ražošana, scFv antivielu ražošana, Fab antivielu ražošana.

Uzņēmumam Alpha Lifetech ir visaptveroša M13/T7 fāgu displeja platforma, lai nodrošinātu antivielu bibliotēku izveidi un ražošanu. Mēs varam sniegt arī pielāgotus pakalpojumus, piemēram, antivielu scFv ražošanu un augstas caurlaidības antivielu skrīningu, lai apmierinātu jūsu vajadzības.

Fāgu displeja bibliotēkas izveides process

Fāgu bibliotēkas konstruēšanas process ir šāds: PCR amplifikācijai tiek izstrādāti specifiski primeri, kas iegūst produktus, kurus ar enzīmu ligē ar T7/M13 fāgu vektoru, un rekombinantā fāgu plazmīda tiek veiksmīgi konstruēta. Rekombinantā fāgu plazmīda tika transformēta TG1 receptoru šūnās, pēc tam pārklāta ar barotni, kas satur atbilstošas antibiotikas, un pēc transformatoru skrīninga tika veikta paplašināta kultūra. Pēc vairākiem kultivēšanas cikliem fāgs replicē replikācijas laikus baktērijās un veiksmīgi ekspresē mērķa proteīnu vai polipeptīdu. Pēc tam fāgu bibliotēka tiek attīrīta, lai noņemtu dažus piemaisījumus un nesaistītos fāgus.

Fāgu displeja bibliotēkas skrīninga metodes

Fāgu displeja antivielu ražošanas panākumi galvenokārt ir atkarīgi no antivielu fāgu displeja bibliotēkām, un izplatītākās fāgu panoramēšanas metodes ir cietfāzes un šķidrfāzes skrīnings. Cietfāzes antigēnu skrīnings bagātina specifiskas antivielas, izmantojot 3-4 eluēšanas kārtas, lai iegūtu antivielu fāgu displeja bibliotēkas; šķidrfāzes antigēnu skrīnings tiek veikts, inkubējot ar biotīnu iezīmētas mērķa un antivielu fāgu displeja bibliotēkas un uztverot saistītos fāgus, izmantojot magnētiskās lodītes. Cietfāzes skrīnings patērē vairāk antigēna, un daži antigēnu epitopi tiek iznīcināti. Šķidrumfāzes skrīningam raksturīga augsta efektivitāte un bagātināšana, bet iegūtās antivielas ir mazāk specifiskas. Fāgu panoramēšanas metode ir atkarīga no eksperimentālajām vajadzībām, un tas viss zināmā mērā ietekmēs fāgu displeja antivielu ražošanas efektu.

Augstas caurlaidības antivielu skrīnings

Mūsdienu medicīnā antivielu izstrāde ir strauji attīstījusies. Pastāv dažādas antivielu izstrādes metodes, taču medicīnas zinātnē vairāk tiek izmantota augstas caurlaidības antivielu skrīnings. Šajā procesā var iegūt lielu antivielu repertuāra daudzveidību. Apvienojot to ar tradicionālajām antivielu bibliotēku skrīninga metodēm, var uzlabot fāgu displeja bibliotēku skrīninga kvalitāti. Pēc bioloģiskās skrīninga antivielas var raksturot ar zemas caurlaidības ELISA vai augstas caurlaidības antivielu skrīningu.

1. att. Plūsmas diagramma, kurā parādīta notikumu secība no fāgu antivielu bibliotēku izveides līdz monoklonālo antivielu ģenerēšanai ar augstu afinitāti pret antigēniem un zemu imunogenitāti.(Atsauces avots: Fāgu displeja tehnoloģija kā spēcīga platforma antivielu zāļu atklāšanai - PMC (nih.gov))

Piesardzības pasākumi antivielu fāgu displeja skrīningāPiesardzības pasākumi

Bufera apsvērumi

Buferu izvēlē jāņem vērā mērķa stabilitāte, saistīšanās mikrovide un minimāla nespecifiska saistīšanās faktiskajā pielietojuma scenārijā. Nesaistīti proteīni, nejonu mazgāšanas līdzekļi un fizioloģiskas sāls koncentrācijas veicina fona samazināšanu. Pastāv arī citi apstākļi, piemēram, dažiem mērķiem var būt nepieciešams buferam pievienot divvērtīgus katjonus vai citus kofaktorus, proteīnu kofaktorus var kofiksēt ar mērķi, tos var pievienot šķirošanas buferim un pat izmantot kā līdzekli mērķa uztveršanai.

Spiediena apsvērumi

Bieži sastopamie atlases spiediena apsvērumi ietver mērķa molekulu koncentrāciju, saistīšanās laiku, mazgāšanas intensitāti utt. Citas metodes atlases spiediena palielināšanai ietver denaturantu (piemēram, skābju, urīnvielas un guanidīna), organisko šķīdinātāju izmantošanu, temperatūras paaugstināšanu vai konkurējošo ligandu vai mērķu koncentrācijas palielināšanu mazgāšanas buferī.
Starp tiem svarīga ir pirmā skrīninga kārta. Pirmā skrīninga kārta ir paredzēta, lai no konstruētās bibliotēkas iegūtu pēc iespējas vairāk pozitīvu klonu, vienlaikus noņemot nespecifiskus klonus. Lai nodrošinātu lielu skaitu saistīto fāgu, lai saglabātu bibliotēkas daudzveidību, jāizmanto poraini pārklāti mērķi vai liels skaits šķīstošu mērķu. Turpmākajās skrīninga kārtās atlases spiediens jāpalielina, palielinot bagātināšanu, vairākkārtēju mazgāšanu un palielinot mazgāšanas laiku, var pārbaudīt klonus ar augstu afinitāti.

Negatīvās skrīninga stratēģija

Antigēnu birkas un nesējmateriāli — skrīninga process ir visu vielu, kas atrodas uz antigēnu konjugātiem, piemēram, birkas, saplūšanas proteīnus un nesošos substrātus, skrīnings. Negatīva nemērķa antivielu skrīninga rezultāts var ierobežot citu antivielu, nevis mērķa antigēna, bagātināšanos.
Veicot transfektētu šūnu līniju skrīningu, veselas šūnas, liposomas, nanofosfolipīdu diskus un VLP var negatīvi skrīningot, izmantojot simulētas transfektētas šūnas vai netransfektētas šūnas.
Sarežģītu antigēnu maisījumu noņemšana. Stingru negatīvu skrīningu var veikt nezināmām vai sarežģītām mērķa molekulām, piemēram, veselām šūnām vai netīriem proteīniem.
Antivielu stratēģija pret specifiskām antigēnu vietām ir tāda, ka viena ir eluēt antivielas, kas var konkurēt ar ligandu, pievienojot augstu ligandu koncentrāciju, bet otra ir bloķēt antivielas.

Fāgu displeja pielietojums

*Antivielu atklāšana mūsdienu medicīnā kļūst arvien svarīgāka. Pastāv dažādas antivielu atklāšanas pieejas, taču medicīnas zinātnē vairāk tiek izmantota fāgu displeja tehnoloģija. Kopš 1990. gada fāgu bibliotēku veidošanai ir izmantoti dažādi antivielu formāti, tostarp VH, VHH, scFv, diaķermeņi un Fab antivielas.
*Fāgu peptīdu bibliotēkas ļauj ātri noteikt olbaltumvielu epitopu secību un ir kļuvušas par spēcīgu instrumentu epitopu un antigēnu receptoru mijiedarbības izpētei.
*Antivielu fragmenti tiek sapludināti ar M13 fāga G3P, un, klonējot lielu skaitu gēnu, kas kodē antivielu fragmentu, var ģenerēt lielas fāgu displeja antivielu bibliotēkas, no kurām var atlasīt daudzas dažādas antivielas.
*T7 fāgu displeja sistēmai ir daudz priekšrocību, tostarp vienkāršība, augsta drošība, stabilitāte, viegla uzglabāšana un transportēšana, tāpēc sistēma tiek izmantota profilaktiskās un terapeitiskās vakcīnās.
*T7 fāgu displeja sistēma var noteikt dažādus antigēnus, piemēram, patogēno mikroorganismu virsmas antigēnus un vēža antigēnus.

Fāgs