Olbaltumvielu-olbaltumvielu mijiedarbības analīzes pakalpojums

Alpha Lifetech var nodrošināt klientiem arī olbaltumvielu testus, olbaltumvielu mijiedarbības analīzi, olbaltumvielu-olbaltumvielu mijiedarbības testus (CO-IP, Western Blot, hromatīna imunoprecipitācijas tests) un olbaltumvielu funkcijas testus, lai apmierinātu dažādu klientu eksperimentālās vajadzības.

SAZINIETIES AR MUMS

Olbaltumvielu-olbaltumvielu mijiedarbības analīzes pakalpojums

Alpha Lifetech daudzus gadus ir dziļi iesaistījies olbaltumvielu testos, izveidojis stabilu platformu olbaltumvielu funkcionālo testu veikšanai un apguvis dažādus tehniskus līdzekļus olbaltumvielu mijiedarbības pārbaudei, kas var ietaupīt zinātnisko pētījumu vai projektu pētījumu laiku, vienlaikus nodrošinot stabilus rezultātus.

Ievads olbaltumvielu-olbaltumvielu mijiedarbības testā

Olbaltumvielas ir vissvarīgākās izpildmolekulas jebkurā dzīvības formā, kas reaģē uz ģenētiskajos materiālos glabātajām instrukcijām. Biežāk olbaltumvielas veic savu darbu, darbojoties kā lomu spēlētāji, kas mijiedarbojas ar citiem proteīniem, kas ir vēl acīmredzamāk, kad proteīna funkcija tiek pārbaudīta reālā šūnas kontekstā. Mijiedarbības starp proteīniem identificēšana ir ļoti svarīga atsevišķa proteīna bioķīmiskajā izpētē. Izplatītāko proteīnu mijiedarbības analīze ir šāda:

Koimunoprecipitācijas tests

Koimunoprecipitācijas metodes princips ir mērķa proteīna, specifiskās antivielas un proteīna A/G magnētisko lodīšu sajaukšana inkubācijai, nesaistītā proteīna supernatants tiek atdalīts, adsorbējot magnētiskās lodītes uz magnētiskā statīva, un magnētiskās lodītes tiek mazgātas, lai noņemtu proteīnu un citus piemaisījumus, ja vien tie nav specifiski saistīti.

1. attēls. Co-IP testu shematiska diagramma.(Atsauces avots: Koimunoprecipitācijas tests — PubMed (nih.gov))

Nolaižamā analīze

Novilkšanas tests paredz zināmā proteīna fiksāciju uz magnētiskās lodītes un nosakāmās vielas pievienošanu. Eluentu nosaka, lai noteiktu mijiedarbojošos proteīnu adsorbciju.

1988. gadā Smits un līdzautori attīrīja GST saplūšanas proteīnu, kas tika izmantots "pull-down" testos un tiek saukts par Gst "pull-down" testu, proti, mērķa proteīnam pievieno GST tagu, uztver mijiedarbojošos proteīnu caur GSH, eluē saistīšanos un pārbauda to ar WB testiem.

2. attēls. GST nolaižamo testu shematiska diagramma.(Atsauces avots: GST pull-down tests PIF4 saistīšanās izpētei in vitro — PubMed (nih.gov) )

Viņa pieeja ir izmantot metāla jonus, piemēram, niķeli vai kobaltu, kā barotni, attīrīt proteīnu, izmantojot afinitātes hromatogrāfiju, un eluēt saistīšanos, izmantojot WB eksperimentu, lai pārbaudītu rezultātu.

Turklāt pastāv DNS vilkšanas (olbaltumvielu DNS saistīšanās tests), RNS vilkšanas (olbaltumvielu RNS mijiedarbības tests) un mazo molekulu vilkšanas testi.

DNS atdalīšanas metode (olbaltumvielu DNS saistīšanās tests) ir in vitro metode olbaltumvielu saistīšanās ar DNS noteikšanai. Vai specifiski proteīni saistās ar mērķa DNS, tika noteikts ar WB testiem; nezināmi DNS fragmenti saistās ar proteīniem, kuri DNS fragmenti ir zināmi ar MS noteikšanu.

RNS Pull-down (olbaltumvielu RNS mijiedarbības tests) ir in vitro metode RNS saistīšanās ar olbaltumvielām noteikšanai. Vai specifiski proteīni saistās ar mērķa RNS, tika noteikts ar WB testiem; nezināmi RNS fragmenti saistījās ar olbaltumvielām, kuri RNS fragmenti ir zināmi ar MS noteikšanu.

SM pull-down (mazo molekulu pull-down testi) var atrast mērķa proteīnus, kas specifiski saistās ar mazām molekulām, un, apvienojumā ar MS, mazo molekulu mērķa proteīnus var precīzi pārbaudīt, ko var iedalīt in vitro marķēšanas metodē un bioloģiski ortogonālā metodē.

WB eksperiments

WB eksperiments (pazīstams arī kā Western Blot eksperiments vai Western blot) ir specifiska antigēna un antivielas reakcija. Pamatprincips ir denaturētu olbaltumvielu atdalīšana, izmantojot SDS poliakrilamīda gela elektroforēzi, un to pārnešana uz cietfāzes nesēju (piemēram, PVDF membrānu, NC membrānu), izmantojot membrānas pārnesi (mitru vai pussausu rotāciju). Pēc bloķēšanas (izmantojot BSA, paniņas utt.) primārā antiviela tiek uzklāta, lai tā specifiski saistītos ar olbaltumvielu, un pēc plēves mazgāšanas pievieno ar fluoresceīnu iezīmēto sekundāro antivielu. Saistot otro antivielu ar primāro antivielu, mērķa olbaltumvielu var novērot, izmantojot substrāta krāsas attīstību un ķīmisko luminiscenci. To parasti izmanto, lai noteiktu, vai paraugā ir ekspresēts konkrēts proteīns, un aptuveni analizētu tā ekspresijas līmeni.

Olbaltumvielu-olbaltumvielu mijiedarbības metodes salīdzinājums

Olbaltumvielu mijiedarbības noteikšanas testi ir līdzīgi Co-IP testiem, kas abi pieder pie olbaltumvielu mijiedarbības noteikšanas eksperimentiem. Atšķirība starp abām metodēm ir tāda, ka Co-IP testi iegūst zināmu olbaltumvielu mijiedarbojošos proteīnus, kam ir zināma autentiskums, bet nevar apstiprināt, vai mijiedarbojošie proteīni mijiedarbojas tieši vai netieši. Novilkšanas testi ir paredzēti, lai atrastu nezināmu proteīnu, kas mijiedarbojas ar zināmo proteīnu. Tie var tieši apstiprināt, vai zināmais proteīns mijiedarbojas ar noteikto proteīnu, bet nevar zināt saistīšanās situāciju in vivo.

Koimunoprecipitācijas tehnoloģija tiek izmantota, lai analizētu, vai pastāv mijiedarbība starp diviem vai vairākiem proteīniem, pamatojoties uz imunoprecipitācijas eksperimentiem. Salīdzinot ar citām proteīnu mijiedarbības analīzes eksperimentālajām metodēm (GST Pull-down, Western Blot, hromatīna imunoprecipitācijas tests utt.), Co-IP tehnoloģijai ir augstāka specifiskums, jutība un augsta atkārtojamība, kas var novērst nespecifiskas saistīšanās traucējumus un atspoguļot proteīnu mijiedarbību dabiskā stāvoklī.

	PVN Pavelciet uz leju	Kopīga intelektuālā īpašuma tiesības	Pasaules Banka
Priekšrocība	* Viegli lietojams *Piemērots dažādu olbaltumvielu attīrīšanai	In vivo mijiedarbības analīzei To var identificēt ar lejupējo proteīnu	Spēcīga specifika Kvalitatīva un kvantitatīva in vitro
Ierobežojums	Varbūt nespecifiska saistīšanās Nepieciešama mijiedarbības papildu validācija.	Spēcīga atkarība no antivielām Var rasties nespecifiska saistīšanās	Laikietilpīgs Grūti izmantot liela mēroga olbaltumvielu analīzei
Pielietojuma piemērs	Identificēt mijiedarbību Attīrīts olbaltumvielu komplekss	Signāla pārvades izpēte Slimības mehānisms	Turpmākā olbaltumvielu-olbaltumvielu, olbaltumvielu-DNS un olbaltumvielu-RNS mijiedarbības analīze