Rauga virsmas displeja bibliotēkas skrīninga pakalpojums

Alpha Lifetech specializējas rauga displeja bibliotēku veidošanā un antivielu bibliotēku skrīningā, piedāvājot iespēju ģenerēt dažādas rauga bibliotēkas un skrīningot tās, lai noteiktu augstas afinitātes un specifiskas antivielas klientiem visā pasaulē. Ar ekspertu pētnieku komandu, progresīvām tehnoloģijām un aprīkojumu mēs varam izveidot rauga bibliotēkas, kas vērstas uz plašu ar slimībām saistītu olbaltumvielu klāstu. Mēs varam nodrošināt fāgu displeja un rauga displeja tehnoloģijas, tostarp olbaltumvielu rauga displeju, mazo molekulu rauga displeju, antivielu rauga displeju utt.

Mūsu rauga displeja bibliotēkām ir liela ietilpība un augsta daudzveidība, kas nodrošina labu pamatu specifisku antivielu secību efektīvai skrīningam. Atbilstoši jūsu vajadzībām mēs varam izveidot dažādas antivielu rauga displeja bibliotēkas (IgG, scFv, VHH, Fab antivielu bibliotēkas), olbaltumvielu bibliotēkas, peptīdu bibliotēkas, kDNS bibliotēkas utt. Turklāt mēs varam izstrādāt arī dažādu īpašību antivielu bibliotēkas, tostarp imūnās bibliotēkas, dabiskās bibliotēkas, sintētiskās bibliotēkas, daļēji sintētiskās bibliotēkas un slimību antivielu bibliotēkas.

Ievads rauga displeja sistēmā

Rauga virsmas displeja tehnoloģija ir metode rekombinantu olbaltumvielu attēlošanai uz rauga virsmas, izmantojot gēnu sapludināšanu. Visizplatītākā rauga displeja sistēma izmanto mērķa olbaltumvielu, kas ir sapludināta ar alfa lektīna savienojošā proteīna Aga2p apakšvienības C-galu, galvenokārt sastāvot no epitopu tagiem abās mērķa olbaltumvielu pusēs: N-gala 9 aminoskābju hemaglutinīna (HA) taga un C-gala 10 aminoskābju c-myc taga. 69 aminoskābju Aga2p apakšvienība saistās ar 725 aminoskābju alfa lektīna Aga1p apakšvienību, izmantojot divas disulfīda saites, un Aga1p ir piesaistīts šūnas sienai, izmantojot β-1,6-glikāna kovalento saiti. Tādējādi mērķa olbaltumviela tiek attēlota uz rauga šūnu virsmas un pēc tam atpazīta ar atbilstošo ligandu. Funkcionālos proteīnus no bibliotēkām var atdalīt, izmantojot plūsmas citometrijas skrīningu.

1. attēls: Rauga virsmas attēlošanas princips. (Attēla avots: Rauga virsmas displeja pielietojums olbaltumvielu inženierijā.)

Ievads rauga virsmas displeja bibliotēkā

Rauga displeja šķirošana balstās uz rauga virsmas displeju, ko galvenokārt izmanto, lai pārbaudītu antivielu bibliotēkas, kas vērstas pret šūnu virsmas olbaltumvielām. Sakarā ar zemo nespecifisko saistīšanos starp rauga šūnām un citām šūnu virsmām, rauga bioloģiskā atlase var pārbaudīt lielas saistīšanās bibliotēkas, lai atrastu retus klonus.

Rauga virsmas displeja bibliotēkas skrīninga pakalpojums

Sagatavot plazmīdas un kultivēt rauga šūnas, sintezēt mērķa proteīnu kodējošo DNS un klonēt to rauga ekspresijas vektorā, kas satur inducējamus promotorus, signālpeptīdus un mērķa gēnus, kas sapludināti ar virsmas displeja proteīniem (piemēram, Aga2p). Gēnu, kas kodē mērķa proteīnu, var sapludināt ar gēnu, kas kodē rauga šūnu sieniņas proteīnu (parasti Aga2p), un sapludināto gēnu var transformēt rauga šūnās, izmantojot elektroporāciju. Pēc transformācijas rauga šūnas, kas uz savas virsmas ekspresē antivielu gēnus, var veikt antigēnspecifiskus skrīninga testus: rauga bibliotēka tiek inkubēta ar mērķa antigēnu, un tiek atlasītas rauga šūnas, kas specifiski saistās ar to. Izmantojot fluorescences aktivētu šūnu šķirošanu (FACS), lai izolētu rauga šūnas, kas attēlo proteīnus ar vēlamajām īpašībām, rauga displeja bibliotēkas skrīningu var veikt ar maksimālo bibliotēkas lielumu ~10^8-10^9 rauga šūnas. Pēc tam pozitīvos klonus var izolēt tālākai analīzei vai pakārtotām lietojumprogrammām. Kad no antivielu bibliotēkas ir identificēti specifiski antivielu kloni, tos var tālāk raksturot un masveidā ražot, kā arī attīrīt, izmantojot tādas metodes kā proteīna A/G afinitātes hromatogrāfija, lai pabeigtu visu rauga displeja skrīninga un antivielu ražošanas procesu.

Rauga displeja bibliotēkas skrīninga process

2. attēls. Rauga displeja bibliotēkas skrīninga process

Rauga displeja bibliotēkas skrīninga pakalpojuma darbplūsma

Soļi	Pakalpojuma saturs	Laika skala
Antigēna sagatavošana	Antigēna tips: Ja klients var nodrošināt antigēnus, atbilstošie paraugi jāpiegādā atbilstoši tipam: rekombinantiem proteīniem nepieciešami 3–3,5 mg ar tīrības prasību virs 85%, mazām molekulām jābūt konjugētām ar tīrības prasību virs 90%, peptīdu sintēzei jābūt konjugētai ar tīrības prasību virs 90%, tādi paraugu veidi kā vīrusi ir jāinaktivē, RNS ir jāpārbauda, lai novērstu degradāciju, un iepriekš minētos antigēnu veidus var arī pielāgot sintēzei.	2–3 nedēļas
Dzīvnieku imunitāte	Dzīvnieku imunizāciju skaits ir 5, un, pamatojoties uz seruma titra testiem, ir jānosaka, vai palielināt imunizāciju skaitu. Antigēnu imunitāte: olbaltumvielu/vīrusa antigēna iedarbība > 105; peptīdu/mazo molekulu antigēna iedarbība > 10^4.	5–6 nedēļas
Veidnes cDNS sagatavošana	Atdalīt plazmas PBMC, ekstrahēt kopējo RNS (RNS ekstrakcijas komplekts) un pārvērst to reversā veidā kDNS.	1 diena
Bibliotēkas būvniecība	Izmantojot bibliotēkas cDNS kā veidni, VHH gēns tika amplificēts divos PCR ciklos, un tika konstruēts VHH gēna splaisēšanas rauga displeja vektors. Vektors tika transformēts rauga šūnās, izmantojot elektroporāciju, lai konstruētu antivielu bibliotēku. Nejauši atlasīti 48 kloni un, izmantojot PCR metodi, noteikts pozitīvās reakcijas ātrums (>90%); aprēķināta bibliotēkas ietilpība (10^7-10^8), NGS sekvencēšana, lai noteiktu pareizu bibliotēkas ievietošanas ātrumu (>90%) un bibliotēkas daudzveidību.	2 nedēļas
Bibliotēkas seanss	Noklusējuma trīs skrīninga kārtas: ar fluorescenci iezīmētu proteīnu FACS skrīnings, kam seko NGS sekvencēšana trešajā kārtā. Pozitīvie kloni tika atlasīti vienas grama indukcijas ekspresijai un ELISA noteikšanai. Visi pozitīvie kloni tika atlasīti gēnu sekvencēšanai, un tika atlasītas dažādas CDR reģiona sekvences.	2–3 nedēļas
Antivielu verifikācija	Atbilstošu ekspresijas vektoru konstruēšana antivielu sekvencēm var atvieglot antivielu ekspresiju, antivielu attīrīšanu, antivielu antigēna saistīšanās validāciju ar ELISA un BLI, lai pārbaudītu antivielu afinitāti, un plūsmas citometrijas blokādi, lai validētu šūnu funkciju.	1 nedēļa

Rauga virsmas displeja bibliotēkas skrīninga gadījums

Rauga virsmas displeja platformas literatūrā, lai ātri atklātu konformāciju selektīvu nanoķermeņus, autori izveidoja pilnīgu in vitro nanoķermeņu atklāšanas platformu, kuras pamatā ir rauga virsmas displejs. Vispirms, sākot ar kamieļu gēniem, tika izstrādāta sintētiska nanoķermeņu bibliotēka. D attēlā redzams, ka nanoķermenim ir HA atzīme karboksilgalā, un pēc tam nanoķermenis ir kovalenti fiksēts pie rauga šūnas sienas. E attēlā parādīts nanoķermeņu skrīninga process. Rauga ar antigēna afinitātes nanoķermeņiem izolēja, amplificēja un atkārtoti atlasīja antivielas, izmantojot FACS. Autori atklāja konformāciju selektīvus nanoķermeņus, kas mērķēti uz diviem dažādiem cilvēka GPCR, izmantojot šo platformu.