Протокол за имунохистохемија (IHC) и често поставувани прашања

Имунохистохемијата (IHC) е техника која е широко користена во клеточната биологија и патологија. Таа овозможува локализација и квантитативна анализа на специфични протеини, антигени или молекуларни маркери со користење на специфично врзување помеѓу антителата и целните антигени и комбинирање на морфолошка анализа во ткивни пресеци. IHC не само што може да се користи за проучување на механизмот на болеста, туку игра и важна улога во дијагностицирањето на ракот, молекуларната локализација на маркерите, истражувањето на функцијата на протеините и така натаму.

Принципот на имунохистохемијата

Пресеците од ткивото обично се фиксираат со хемиски реагенси како што е формалин за време на процесот на фиксација, што може да предизвика заматување на антигенскиот епитоп. Затоа, во IHC експериментите, прво е потребно да се изложат епитопите на антигенот преку поправка на антигенот (како што е поправка на антиген предизвикана од топлина или поправка предизвикана од ензими). Преку овој процес, вкрстено поврзаните молекули во процесот на имобилизација можат да се отстранат, тридимензионалната структура на антигенот може да се обнови и врзувањето на антителата може да се олесни. Јадрото на имунохистохемискиот експеримент е реакцијата антиген-антитело. Со примена на специфично примарно антитело (примарно антитело), тоа може да се врзе за целниот антиген во пресекот за да формира комплекс антиген-антитело. За да се подобри сигналот и да се подобри чувствителноста на детекцијата, во IHC експериментите се користеа секундарни антитела (секундарни антитела). Секундарното антитело е антитело против вид добиен од примарно антитело (како што се антитела од зајак против глушец), а маркер (како што е ензим или флуоресцентна боја) обично се прикачува на секундарното антитело. Преку комбинацијата на секундарно антитело и примарно антитело, маркерите можат да се прикачат на комплексот антиген-антитело за да се засили сигналот и да се олесни последователното откривање. Најчесто користените маркери вклучуваат рен пероксидаза (HRP) и алкална фосфатаза (AP). Маркерите на секундарното антитело генерираат видливи сигнали преку специфични реакции. Ако маркерот е ензим, откако секундарното антитело ќе се врзе, ензимот реагира со соодветниот супстрат за да формира талог или обоена реакција, со што се набљудува позицијата на маркерот под микроскоп. Вообичаената реакција на ензимски супстрат е DAB (3,3'-диаминобензидин) реакцијата, која може да генерира кафеав талог и јасно да ја покаже локацијата на антигенот. Во некои случаи, маркерот може да биде флуоресцентна боја, која потоа се набљудува со помош на флуоресцентен микроскоп за да се генерира флуоресцентен сигнал на одредена бранова должина. Во IHC експериментите, нуклеарните бои како што е хематоксилин обично се користат како контрастно боење за да се разликува јадрото од цитоплазмата, со цел појасно да се лоцира локацијата на антигенот.

Чекорите на имунохистохемијата

Подготовка на примерокот

Примероците од ткивото беа земени, правилно фиксирани (како што е фиксација со формалин), а потоа вградени во парафин. За да се направат пресеци од ткиво, вообичаената дебелина е 4-6 микрони, а пресеците треба да се постават на стаклото. Депарафинизацијата се изведува со употреба на ксилен или други растворувачи за депарафин за отстранување на парафински восок, постепено се мијат со етанол и на крај се мијат со дестилирана вода.

Поправка на антиген

Процесот на фиксација може да ги покрие епитопите на некои антигени, па затоа е потребна поправка на антигени. Најчесто користените методи вклучуваат поправка на антигени предизвикана од топлина (HIER) и поправка предизвикана од ензими. Методот HIER е да се постави парчето во пуфер со висока температура (како што е пуфер со лимонска киселина) и да се активира антигенскиот епитоп со висока температура. Ензимски-индуцираната поправка (EIER) користи специфични ензими за отстранување на маската на антигенот предизвикана од процесите на вкрстено поврзување или фиксација во ткивата, со што се обновува епитопот на антигенот и се овозможува тој да биде препознаен и врзан од специфични антитела. Овој метод е особено погоден за оние антигени кои не можат да се обноват со традиционална поправка на антигени предизвикана од топлина (HIER), особено некои маркери на клеточната површина или пофрагилни антигени.

Блокирање на неспецифично врзување

Пресеците беа третирани со раствор за блокирање (како раствор што содржи говедски серумски албумин (BSA) или нормален козји серум) за да се избегне неспецифично врзување на секундарните антитела.

Инкубација на примарни антитела

Со инкубирање на специфичното примарно антитело со пресекот, примарното антитело специфично ќе се врзе за целниот антиген во пресекот. Времето на инкубација и температурата треба да се оптимизираат според карактеристиките на примарното антитело.

Секундарна инкубација на антитела

По инкубацијата со примарното антитело, секундарното антитело што одговара на примарниот вид антитело се користи за инкубација, а секундарното антитело обично се комбинира со маркерот (како што е ензим или флуоресцентна боја) за последователна амплификација на сигналот.

Реакција на боја

Вообичаените методи за развој на боја вклучуваат врзување на HRP (рен пероксидаза) за подлогата за да се формира производ во боја или користење на флуоресцентно обележано секундарно антитело за флуоресцентна микроскопија. Процесот на боење ќе го зголеми боењето на позицијата на антигенот, така што таа ќе може да се види.

Нуклеарно контрастно боење

Хематоксилинот обично се користи за нуклеарно боење за да се спореди локацијата на антигените и јадрата под микроскоп.

Запечатување

По боењето, деловите беа запечатени со средство за заптивање за микроскопско набљудување. Изборот на лепило за заптивање треба да обезбеди долгорочно зачувување на резултатите од боењето.

Микроскопско набљудување и анализа

Обработените ткивни делови беа набљудувани со микроскоп за да се анализира локацијата, експресијата и дистрибуцијата на антигените. Според интензитетот на боење и морфологијата на ткивото, во комбинација со квантитативна анализа (како што е софтвер за анализа на слики) за понатамошна евалуација.

Слика 1. Дијаграм што го прикажува механизмот на секоја од платформите mIHC/IF. (A) DISCOVERY ULTRA систем: по примарната инкубација на антитела, се воведува секундарно антитело обележано со HRP. HRP реагира со соодветен супстрат врзан за хромогена боја, што доведува до таложење на нерастворливи, обоени преципитати на местото каде што се наоѓаат антигените. (B) IHC техники базирани на метали, како што се IMC и MIBI: примарно антитело врзано за целниот антиген е обележано со метален изотоп со позната молекуларна маса. Анализата се спроведува со употреба на масена спектрометрија во MIBI и ласерска аблација поврзана со масена цитометрија во IMC. (C) Vectra: по примарната инкубација на антитела, се воведува секундарно антитело обележано со HRP. Молекул на тирамид конјугиран со флуорофор служи како супстрат за HRP, што резултира со сигнал на флуоресценција поврзан со антиген. (D) Nanostring DSP: целниот антиген ќе се врзе со примарното антитело кое е поврзано со фоторазцеплива олигонуклеотидна ознака. УВ светлината се користи за раскинување на олигонуклеотидните ознаки и се собира со помош на микрокапиларна цевка и се складира во микроплоча. Олигонуклеотидните ознаки ќе се врзат за репортерската сонда преку специфичната сонда за фаќање за целта. Репортерските сонди се снимаат и се бројат со помош на системот за анализа nCounter. Кратенки: mIHC/IF, мултиплекс имунохистохемија/имунофлуоресценција; HRP, рен пероксидаза; IHC, имунохистохемија; IMC, масена цитометрија со слики; MIBI, мултиплексирано јонско зрак снимање; DSP, дигитално просторно профилирање. (Референтен извор: Преглед на техниките на мултиплекс имунохистохемија/имунофлуоресценција во ерата на имунотерапијата на ракот.)

Предности на имунохистохемијата

Висока специфичност: Преку специфичноста на реакцијата антиген-антитело, целната молекула може прецизно да се позиционира на ниво на ткиво.

Морфолошки информации: IHC не само што обезбедува информации на молекуларно ниво, туку ги комбинира и морфолошките карактеристики на хистолошките пресеци за да обезбеди анализа на локализација на ниво на ткиво или клетки.

Повеќекратно откривање: повеќекратното боење може да се изврши со употреба на различни антитела и комбинирање на различни маркери за да се открие експресијата и локализацијата на повеќе антигени.

Примена на имунохистохемија

Дијагноза на рак

IHC може да помогне во идентификување на специфични молекуларни маркери во клетките на ракот за класификација на ракот, стадиумирање и евалуација на прогнозата.

Патолошко истражување

IHC се користи во областа на патологијата за анализа на различни видови ткива и клетки со цел да се проценат карактеристиките и механизмите на одредени болести.

Имунолошки истражувања

IHC може да се користи за проучување на функцијата на имунолошкиот систем и интеракцијата меѓу клетките. Може да помогне во идентификување на специфични подгрупи на имунолошки клетки, проценка на имунолошкиот одговор и неговата врска со болеста.

Студија за маркери на болести

Со означување на специфични антигени, IHC може да помогне во откривањето на нови маркери на болести. На пример, може да се користи за проучување на воспалителни реакции или молекуларни маркери на одредени бактериски и вирусни инфекции.

Развој на лекови и клинички испитувања

IHC се користи за евалуација на ефектите на новите лекови врз клетките или ткивата за време на развојот на лекови, особено со набљудување на промените во експресијата на специфични протеини. Покрај тоа, се користи и во клинички испитувања за следење на одговорот на пациентите на лекови.

Алфа Лајфтек обезбедува висококвалитетни, репродуцибилни резултати со прецизно оптимизирање на секој тест за специфичните антитела и типови ткива што се користат. Тие се грижат за широк спектар на истражувачки потреби, од основна наука до транслациони и клинички студии. Посветеноста на Алфа Лајфтек кон прецизност и извонредност ги прави доверлив партнер за истражувачите кои сакаат да го унапредат своето разбирање на биолошките системи и да ги подобрат резултатите од здравствената заштита.

Најчесто поставувани прашања

1. Неспецифично боење често се јавува кај IHC експериментите, односно антителата можат да се врзат за други молекули различни од целта, што резултира со премногу силно боење во позадина и влијае на толкувањето на резултатите.

Решенија: (1) Користени се соодветни контролни групи: вклучувајќи негативни контроли (не се додадени примарни или секундарни антитела) и позитивни контроли (ткива за кои е познато дека го експресираат целниот протеин) за да се потврди специфичноста на боењето. (2) Оптимизирање на концентрацијата на антитела: Намалувањето на концентрацијата на антителото понекогаш може да го намали неспецифичното врзување. Се препорачува да се користи минималната ефективна концентрација. (3) Блокирање на позадина: Користење на соодветни блокирачки агенси (како што се нормален серум, BSA, итн.), прилагодување на концентрацијата на блокирачкиот агенс, блокирање на неспецифичните места за врзување на делот. (4) Подобрување на чекорите за перење: Зголемете го бројот на перења или продолжете го времето за отстранување на неспецифично врзани антитела.
2. Целниот протеин може да не се детектира во IHC експериментите. Може да се должи на тоа што сигналот за боење е премногу слаб или воопшто нема сигнал.

Решенија: (1) Проверете ја ефикасноста на антителото: осигурајте се дека врзувањето на антителото за целниот протеин е ефикасно и ги исполнува експерименталните барања. Обидете се со антитела од различни извори. (2) Продолжување на времето на инкубација на антителата: Соодветното продолжување на времето на инкубација на антителото може да го подобри сигналот. (3) Оптимизирање на концентрацијата на антителата: Понекогаш намалувањето на концентрацијата на антителата (особено примарното антитело) помага да се намали неспецифичното врзување, со што се зголемува интензитетот на сигналот. (4) Оптимизирање на чекорот на поправка на антигенот: Ако целниот протеин е скриен во делот од ткивото поради процесот на фиксација, користењето на соодветен метод на поправка на антигенот може да помогне во враќањето на неговата детектабилност.
3. Лошиот квалитет на деловите од ткивото (како што се премногу тенки, премногу дебели, оштетување на ткивото итн.) може да влијае на ефектот на боење.

Решенија: (1) Оптимизација на дебелината на парчето: За IHC експерименти обично се препорачуваат ткивни пресеци од 4-6 μm. Премногу тенки пресеци може да го изгубат целниот протеин, додека премногу дебели пресеци може да доведат до нерамномерно боење. (2) Правилна фиксација на ткивото: користете соодветен фиксатор (како што е 10% формалин) и осигурајте се дека ткивото е целосно фиксирано за да се избегне атрофија или деформација на ткивото. (3) Зачувување на ткивото: Осигурајте се дека пресеците се правилно зачувани и избегнете деградација или денатурација на антигенот поради неправилно зачувување.
4. Антителото може да предизвика неуспех во боењето поради недоволен афинитет, вкрстена реакција и други причини.

Решение: (1) Изберете го соодветното антитело: изберете го антителото за кое е потврдено дека е ефикасно. Може да се упатат или купат комерцијални антитела со доволна верификација. (2) Користење на секундарно антитело со повисок квалитет: Квалитетот на секундарното антитело е многу важен за подобрување на сигналот и контрола на боењето на позадината. Користете секундарни антитела со висок афинитет и ниска позадина. (3) Оптимизација на условите за инкубација: Осигурајте се дека температурата, времето и пуферските услови за инкубација на антителата ги исполнуваат барањата на упатствата за антитела.

референца

[1] Хусаини ХМ, Сео Б, Рич АМ. Имунохистохемија и имунофлуоресценција. Методи Мол Биол. 2023;2588:439-450. doi:10.1007/978-1-0716-2780-8_26

[2] Рамос-Вара ЈА. Технички аспекти на имунохистохемијата. Vet Pathol. 2005;42(4):405-426. doi:10.1354/vp.42-4-405

[3] Tan WCC, Nerurkar SN, Cai HY, et al. Преглед на техниките на мултиплекс имунохистохемија/имунофлуоресценција во ерата на имунотерапијата на ракот. Cancer Commun (Лондон). 2020;40(4):135-153. doi:10.1002/cac2.12023

[4] Морено В, Смит ЕА, Пиња-Овиедо С. Флуоресцентна имунохистохемија. Методи Мол Биол. 2022;2422:131-146. doi:10.1007/978-1-0716-1948-3_9

[5] Ортиз Идалго К. Имунохистохемија во историска перспектива: Познавање на минатото за разбирање на сегашноста. Methods Mol Biol. 2022;2422:17-31. doi:10.1007/978-1-0716-1948-3_2