Мөөгөнцрийн гадаргуугийн дэлгэцийн номын сангийн скрининг үйлчилгээ

Манай мөөгөнцрийн дэлгэцийн сангууд нь том багтаамжтай, олон янз байдаг тул тодорхой эсрэгбиеийн дарааллыг үр дүнтэй шалгах өндөр суурь болдог.

ХОЛБОО БАРИХ

Мөөгөнцрийн гадаргуугийн дэлгэцийн номын сангийн скрининг үйлчилгээ

Alpha Lifetech нь мөөгөнцрийн дэлгэцийн номын сан байгуулах, эсрэгбиеийн номын сангуудыг скрининг хийх чиглэлээр мэргэшсэн бөгөөд дэлхий даяарх үйлчлүүлэгчдэд зориулсан мөөгөнцрийн номын сангуудын янз бүрийн хэлбэрийг бий болгож, өндөр хамааралтай байдал болон өвөрмөц эсрэгбиеийн шинжилгээ хийх боломжийг санал болгодог. Мэргэжлийн судлаачдын баг, дэвшилтэт технологи, тоног төхөөрөмжийн тусламжтайгаар бид өвчинтэй холбоотой олон төрлийн уургийг чиглүүлсэн мөөгөнцрийн номын сангуудыг байгуулж чадна. Бид уургийн мөөгөнцрийн дэлгэц, жижиг молекулын мөөгөнцрийн дэлгэц, эсрэгбиеийн мөөгөнцрийн дэлгэц гэх мэт фагийн дэлгэц болон мөөгөнцрийн дэлгэцийн технологийг санал болгож чадна.

Манай мөөгөнцрийн дэлгэцийн сангууд нь том багтаамжтай, олон янз байдаг тул тодорхой эсрэгбиеийн дарааллыг үр дүнтэй шалгах өндөр суурь болдог. Бид таны хэрэгцээнд нийцүүлэн янз бүрийн хэлбэрийн эсрэгбиеийн мөөгөнцрийн дэлгэцийн сангууд (IgG, scFv, VHH, Fab эсрэгбиеийн сангууд), уургийн сангууд, пептидийн сангууд, кДНХ-ийн сангууд гэх мэтийг бүтээж болно. Нэмж дурдахад бид дархлааны сангууд, байгалийн сангууд, синтетик сангууд, хагас синтетик сангууд, өвчний эсрэгбиеийн сангууд зэрэг янз бүрийн шинж чанартай эсрэгбиеийн сангуудыг боловсруулж чадна.

Мөөгөнцрийн дэлгэцийн системийн танилцуулга

Мөөгөнцрийн гадаргуугийн дэлгэцийн технологи нь генийн нэгдэлээр дамжуулан мөөгөнцрийн гадаргуу дээр рекомбинант уургуудыг харуулах арга юм. Хамгийн түгээмэл мөөгөнцрийн дэлгэцийн систем нь альфа лектин холбогч уургийн Aga2p дэд нэгжийн С-төгсгөлд нийлсэн зорилтот уургийг ашигладаг бөгөөд голчлон зорилтот уургийн хоёр талд байрлах эпитопын шошго: N-төгсгөл 9-амин хүчлийн гемагглютинин (HA) шошго болон C-төгсгөл 10 амин хүчлийн c-myc шошго зэргээс бүрдэнэ. 69 амин хүчлийн Aga2p дэд нэгж нь хоёр дисульфидын холбоогоор дамжуулан 725 амин хүчлийн альфа лектин Aga1p дэд нэгжтэй холбогддог бөгөөд Aga1p нь β 1,6-глюкан ковалент холбоогоор дамжуулан эсийн хананд бэхлэгддэг. Тиймээс зорилтот уураг нь мөөгөнцрийн эсийн гадаргуу дээр гарч ирэх бөгөөд дараа нь харгалзах лигандаар танигддаг. Урсгалын цитометрийн скринингээр дамжуулан функциональ уургуудыг сангуудаас тусгаарлана.

Зураг 1: Мөөгөнцрийн гадаргуугийн дэлгэцийн зарчим. (Зургийн эх сурвалж: Уургийн инженерчлэлд мөөгөнцрийн гадаргуугийн дэлгэцийн хэрэглээ.)

Мөөгөнцрийн гадаргуугийн дэлгэцийн номын сангийн танилцуулга

Мөөгөнцрийн дэлгэцийн ялгалт нь мөөгөнцрийн гадаргуугийн дэлгэц дээр суурилдаг бөгөөд голчлон эсийн гадаргуугийн уургуудыг чиглүүлсэн эсрэгбиеийн сангуудыг илрүүлэхэд ашиглагддаг. Мөөгөнцрийн эсүүд болон бусад эсийн гадаргуугийн хоорондох өвөрмөц бус холболт бага байдаг тул мөөгөнцрийн биологийн сонголт нь ховор клонуудыг олохын тулд том холболтын сангуудыг шалгаж чаддаг.

Мөөгөнцрийн гадаргуугийн дэлгэцийн номын сангийн скрининг үйлчилгээ

Плазмид болон мөөгөнцрийн эсийг бэлтгэж, зорилтот уургийг кодчилдог ДНХ-г нийлэгжүүлж, индукцтэй промотор, дохионы пептид, гадаргуугийн дэлгэцийн уургуудтай (жишээ нь Aga2p) нэгтгэсэн зорилтот генүүдийг агуулсан мөөгөнцрийн экспрессийн вектор болгон клончилно. Зорилтот уургийг кодчилдог генийг мөөгөнцрийн эсийн ханын уургийг кодчилдог гентэй (ихэвчлэн Aga2p) нэгтгэж болох бөгөөд нэгтгэсэн генийг электропорациар дамжуулан мөөгөнцрийн эс болгон хувиргаж болно. Хувиргалтын дараа гадаргуу дээрээ эсрэгбиеийн генийг илэрхийлдэг мөөгөнцрийн эсүүд антигенд өвөрмөц скрининг шинжилгээнд хамрагдаж болно: мөөгөнцрийн санг зорилтот антигентэй инкубацилж, түүнтэй тусгайлан холбогддог мөөгөнцрийн эсүүдийг сонгоно. Хүссэн шинж чанартай уургийг харуулдаг мөөгөнцрийн эсийг ялгахын тулд флуоресценцийн идэвхжүүлсэн эсийн ялгах (FACS) ашиглан мөөгөнцрийн дэлгэцийн номын сангийн скринингийг хамгийн ихдээ ~10 ^ 8-10 ^ 9 мөөгөнцрийн эсийн хэмжээтэйгээр хийж болно. Дараа нь эерэг клонуудыг цаашдын шинжилгээ эсвэл дараагийн хэрэглээнд зориулж тусгаарлаж болно. Эсрэгбиеийн сангаас тодорхой эсрэгбиеийн клонуудыг тодорхойлсны дараа тэдгээрийг цаашид тодорхойлж, олноор нь үйлдвэрлэж, мөөгөнцрийн дэлгэцийн скрининг болон эсрэгбие үйлдвэрлэх бүх үйл явцыг дуусгахын тулд уургийн A/G хамаарлын хроматографи зэрэг техникийг ашиглан цэвэршүүлж болно.

Мөөгөнцрийн дэлгэцийн номын сангийн үзлэгийн үйл явц

Зураг 2. Мөөгөнцрийн дэлгэцийн номын сангийн скрининг үйл явц

Мөөгийг харуулах номын сангийн скрининг үйлчилгээний ажлын урсгал

Алхамууд	Үйлчилгээний контент	Цаг хугацааны шугам
Антиген бэлтгэх	Антигенийн төрөл: Хэрэв үйлчлүүлэгч антиген өгөх боломжтой бол харгалзах дээжийг төрлөөс нь хамааруулан хүргэх шаардлагатай: рекомбинант уургууд нь 85%-иас дээш цэвэршилтийн шаардлага бүхий 3-3.5 мг, жижиг молекулуудыг 90%-иас дээш цэвэршилтийн шаардлага бүхий коньюгат хийх шаардлагатай, пептидийн нийлэгжилтийг 90%-иас дээш цэвэршилтийн шаардлага бүхий коньюгат хийх шаардлагатай, вирус зэрэг дээжийн төрлийг идэвхгүйжүүлэх, РНХ-ийг задралаас урьдчилан сэргийлэхийн тулд шалгах шаардлагатай бөгөөд дээрх антигенийн төрлүүдийг мөн синтез хийхэд тохируулан өөрчилж болно.	2-3 долоо хоног
Амьтны дархлаа	Амьтны дархлаажуулалтын тоо 5 бөгөөд сийвэнгийн титр шинжилгээнд үндэслэн дархлаажуулалтын тоог нэмэгдүүлэх эсэхийг тодорхойлох шаардлагатай. Антигенийн дархлаа: уураг/вирусын эсрэгтөрөгчийн чадавхи>105; Пептид/жижиг молекулын эсрэгтөрөгчийн чадавхи>10^4	5-6 долоо хоног
Загвар кДНХ бэлтгэх	Сийвэнгийн PBMC-үүдийг салгаж, нийт РНХ (РНХ ялгах хэрэгсэл)-ийг гаргаж аваад кДНХ болгон буцаана.	1 өдөр
Номын сангийн барилга	Номын сангийн кДНХ-г загвар болгон ашиглан VHH генийг хоёр удаагийн PCR-ээр олшруулж, VHH генийн залгах мөөгөнцрийн дэлгэцийн векторыг байгуулсан. Векторыг электропорациар мөөгөнцрийн эс болгон хувиргаж, эсрэгбиеийн номын сан байгуулсан. Санамсаргүй байдлаар 48 клоныг сонгож, PCR аргыг ашиглан эерэг түвшинг (>90%) тодорхойл; Номын сангийн багтаамж (10^7-10^8), NGS дарааллыг тооцоолж, номын сангийн оруулгын зөв түвшинг (>90%) болон номын сангийн олон янз байдлыг тодорхойл.	2 долоо хоног
Номын сангийн үзлэг	Анхдагч гурван үе шатны скрининг: Флуоресценцийн шошготой уургийн FACS скрининг, дараа нь гурав дахь үе шатанд NGS дарааллыг тогтооно. Нэг грамм индукцийн экспресс болон ELISA илрүүлэлтэд эерэг клонуудыг сонгосон. Генийн дарааллыг тогтооход бүх эерэг клонуудыг сонгосон бөгөөд өөр өөр CDR бүсийн дарааллыг сонгосон.	2-3 долоо хоног
Эсрэгбиеийн баталгаажуулалт	Эсрэгбиеийн дарааллын зохих илэрхийлэлийн векторуудыг бүтээх нь эсрэгбиеийн илэрхийлэл, эсрэгбиеийн цэвэршүүлэлт, эсрэгбиеийн хамаарлыг баталгаажуулахын тулд эсрэгбиеийн антигенийн холболтыг ELISA болон BLI аргаар баталгаажуулах, эсийн үйл ажиллагааг баталгаажуулахын тулд урсгалын цитометрийн блокийг хөнгөвчлөхөд тусалдаг.	1 долоо хоног

Мөөгөнцрийн гадаргуугийн дэлгэцийн номын сангийн үзлэгийн тохиолдол

Конформацийн хувьд сонгомол нано биетүүдийг хурдан илрүүлэх мөөгөнцрийн гадаргуугийн дэлгэцийн платформын талаарх судалгаанд зохиогчид мөөгөнцрийн гадаргуугийн дэлгэц дээр суурилсан бүрэн in vitro нано биет илрүүлэх платформыг бий болгосон. Нэгдүгээрт, тэмээний генээс эхлэн синтетик нано биетийн санг зохион бүтээсэн. Зураг D-д нано биет нь карбоксил төгсгөлд HA шошготой бөгөөд дараа нь нано биет нь мөөгөнцрийн эсийн хананд ковалент байдлаар бэхлэгдсэн болохыг харуулсан. Зураг E-д нано биетийн скрининг процессыг харуулав. Антигентэй холбоотой мөөгөнцрийн нано биетүүдийг ялгаж, олшруулж, FACS-ээр эсрэгбиеийн хувьд дахин дахин сонгосон. Зохиогчид энэ платформоор дамжуулан хоёр өөр хүний GPCR-ийг чиглүүлсэн конформацийн сонгомол нано биетүүдийг илрүүлсэн.