Perkhidmatan Penyaringan Perpustakaan Paparan Permukaan Yis

Alpha Lifetech pakar dalam pembinaan perpustakaan paparan yis dan penyaringan perpustakaan antibodi, menawarkan keupayaan untuk menghasilkan pelbagai bentuk perpustakaan yis dan menyaringnya untuk antibodi afiniti tinggi dan spesifik untuk pelanggan di seluruh dunia. Dengan pasukan penyelidik pakar, teknologi dan peralatan canggih, kami boleh membina perpustakaan yis yang menyasarkan pelbagai jenis protein berkaitan penyakit. Kami boleh menyediakan teknologi paparan phage dan paparan yis, termasuk paparan yis protein, paparan yis molekul kecil, paparan yis antibodi, dan sebagainya.

Pustaka paparan yis kami mempunyai kapasiti yang besar dan kepelbagaian yang tinggi, yang menyediakan asas yang tinggi untuk penyaringan jujukan antibodi tertentu yang berkesan. Kami boleh membina pelbagai bentuk pustaka paparan yis antibodi (IgG, scFv, VHH, pustaka antibodi Fab), pustaka protein, pustaka peptida, pustaka cDNA, dan sebagainya mengikut keperluan anda. Di samping itu, kami juga boleh membangunkan pustaka antibodi dengan pelbagai sifat, termasuk pustaka imun, pustaka semula jadi, pustaka sintetik, pustaka separa sintetik dan pustaka antibodi penyakit.

Pengenalan kepada Sistem Paparan Yis

Teknologi paparan permukaan yis merupakan kaedah untuk memaparkan protein rekombinan pada permukaan yis melalui gabungan gen. Sistem paparan yis yang paling biasa menggunakan protein sasaran yang digabungkan dengan C-terminus subunit Aga2p protein kawin alfa lektin, terutamanya yang terdiri daripada tag epitop pada kedua-dua belah protein sasaran: tag hemagglutinin (HA) asid amino 9-terminal N dan tag c-myc asid amino 10-terminus C. Subunit 69 asid amino Aga2p mengikat kepada subunit 725 alfa lektin asid amino Aga1p melalui dua ikatan disulfida, dan Aga1p berlabuh pada dinding sel melalui ikatan kovalen β 1,6-glukan. Oleh itu, protein sasaran dipaparkan pada permukaan sel yis dan seterusnya dikenali oleh ligan yang sepadan. Asingkan protein berfungsi daripada perpustakaan melalui saringan sitometri aliran.

Rajah 1: Prinsip paparan permukaan yis. (Sumber Rajah: Aplikasi Paparan Permukaan Yis untuk Kejuruteraan Protein.)

Pengenalan kepada Perpustakaan Paparan Permukaan Yis

Pengisihan paparan yis adalah berdasarkan paparan permukaan yis, terutamanya digunakan untuk menapis perpustakaan antibodi yang menyasarkan protein permukaan sel. Disebabkan oleh pengikatan bukan spesifik yang rendah antara sel yis dan permukaan sel lain, pemilihan biologi yis boleh menapis perpustakaan pengikatan yang besar untuk mencari klon yang jarang ditemui.

Perkhidmatan Penyaringan Perpustakaan Paparan Permukaan Yis

Sediakan plasmid dan kulturkan sel yis, sintesis DNA yang mengekod protein sasaran dan klonkannya ke dalam vektor ekspresi yis yang mengandungi promoter yang boleh diinduksi, peptida isyarat dan gen sasaran yang digabungkan dengan protein paparan permukaan (seperti Aga2p). Gen yang mengekod protein sasaran boleh digabungkan dengan gen yang mengekod protein dinding sel yis (biasanya Aga2p), dan gen yang digabungkan boleh diubah menjadi sel yis melalui elektroporasi. Selepas transformasi, sel yis yang mengekspresikan gen antibodi pada permukaannya boleh menjalani ujian saringan khusus antigen: perpustakaan yis diinkubasi dengan antigen sasaran dan sel yis yang secara khusus mengikatnya dipilih. Menggunakan penyisihan sel yang diaktifkan pendarfluor (FACS) untuk mengasingkan sel yis yang memaparkan protein dengan ciri-ciri yang diingini, saringan perpustakaan paparan yis boleh dilakukan dengan saiz perpustakaan maksimum ~10 ^ 8-10 ^ 9 sel yis. Klon positif kemudiannya boleh diasingkan untuk analisis lanjut atau aplikasi hiliran. Sebaik sahaja klon antibodi tertentu dikenal pasti daripada perpustakaan antibodi, ia boleh dicirikan selanjutnya dan dihasilkan secara besar-besaran, dan ditulenkan menggunakan teknik seperti kromatografi afiniti protein A/G untuk melengkapkan keseluruhan proses saringan paparan yis dan penghasilan antibodi.

Proses Penyaringan Perpustakaan Paparan Yis

Rajah 2 Proses penyaringan pustaka paparan yis

Aliran Kerja Perkhidmatan Penyaringan Perpustakaan Paparan Yis

Langkah-langkah	Kandungan Perkhidmatan	Garis Masa
Persediaan Antigen	Jenis antigen: Jika pelanggan boleh menyediakan antigen, sampel yang sepadan perlu dihantar mengikut jenis: protein rekombinan memerlukan 3-3.5mg dengan keperluan ketulenan lebih 85%, molekul kecil perlu dikonjugasikan dengan keperluan ketulenan lebih 90%, sintesis peptida perlu dikonjugasikan dengan keperluan ketulenan lebih 90%, jenis sampel seperti virus perlu dinyahaktifkan, RNA perlu diperiksa untuk mencegah degradasi, dan jenis antigen di atas juga boleh disesuaikan untuk sintesis.	2-3 minggu
Kekebalan Haiwan	Bilangan imunisasi haiwan ialah 5, dan adalah perlu untuk menentukan sama ada perlu meningkatkan bilangan imunisasi berdasarkan ujian titer serum. Imuniti antigen: potensi antigen protein/virus>105; potensi antigen peptida/molekul kecil>10^4	5-6 minggu
Penyediaan cDNA templat	Asingkan PBMC plasma, ekstrak jumlah RNA (kit pengekstrakan RNA) dan balikkan kepada cDNA.	1 hari
Pembinaan Perpustakaan	Menggunakan cDNA perpustakaan sebagai templat, gen VHH telah diamplifikasikan melalui dua pusingan PCR, dan vektor paparan yis penyambungan gen VHH telah dibina. Vektor tersebut telah diubah menjadi sel yis melalui elektroporasi untuk membina perpustakaan antibodi. Pilih 48 klon secara rawak dan kenal pasti kadar positif (>90%) menggunakan kaedah PCR; Kira kapasiti perpustakaan (10^7-10^8), penjujukan NGS untuk menentukan kadar penyisipan perpustakaan yang betul (>90%) dan kepelbagaian perpustakaan.	2 minggu
Tayangan Perpustakaan	Tiga pusingan saringan lalai: Saringan FACS protein berlabel pendarfluor, diikuti dengan penjujukan NGS pada pusingan ketiga. Klon positif dipilih untuk ekspresi induksi gram tunggal dan pengesanan ELISA. Semua klon positif dipilih untuk penjujukan gen, dan jujukan kawasan CDR yang berbeza dipilih.	2-3 minggu
Pengesahan Antibodi	Membina vektor ekspresi yang sesuai untuk urutan antibodi boleh memudahkan ekspresi antibodi, penulenan antibodi, pengesahan ELISA dan BLI bagi pengikatan antigen antibodi untuk mengesahkan afiniti antibodi dan sekatan sitometri aliran untuk mengesahkan fungsi sel.	1 minggu

Kes Saringan Perpustakaan Paparan Permukaan Yis

Dalam literatur platform paparan permukaan yis untuk penemuan pantas nanobodi selektif konformasional, penulis telah mewujudkan platform penemuan nanobodi in vitro yang lengkap berdasarkan paparan permukaan yis. Pertama, perpustakaan nanobodi sintetik telah direka bentuk bermula daripada gen unta. Rajah D menunjukkan bahawa nanobodi mempunyai tag HA pada hujung karboksil, dan kemudian nanobodi dilekatkan secara kovalen pada dinding sel yis. Rajah E menunjukkan proses penyaringan nanobodi. Yis dengan nanobodi afiniti antigen telah diasingkan, dikuatkan dan dipilih berulang kali untuk antibodi oleh FACS. Penulis menemui nanobodi selektif konformasional yang menyasarkan dua GPCR manusia yang berbeza melalui platform ini.