Platform voor het meten van affiniteit

Alpha Lifetech biedt, met behulp van het Octet- en Biacore-T2000-platform, betrouwbare diensten voor affiniteitsbepaling. We kunnen affiniteitsbepalingen uitvoeren voor diverse monsters, zoals antilichamen, cellen, eiwitten, kleine moleculen, enzovoort. Er bestaan verschillende methoden voor affiniteitsbepaling, waaronder oppervlakteplasmonresonantie (SPR) en bio-laaginterferentie (BLI).

Alpha Lifetech beschikt over een professioneel en nauwkeurig platform voor affiniteitsbepaling dat ELISA combineert met affiniteitsbepaling. Dit platform levert professionele, efficiënte, snelle en precieze resultaten voor affiniteitsbepaling aan klanten wereldwijd. We bieden twee methoden waaruit klanten kunnen kiezen: snelle affiniteitsbepaling en precieze affiniteitsbepaling. Snelle affiniteitsbepaling is een bepaling van één enkele concentratie, terwijl precieze affiniteitsbepaling de affiniteit van verschillende concentraties kan meten. Het platform is geschikt voor onderzoek naar interacties tussen diverse kleine moleculen, peptiden, eiwitten, oligonucleotiden en oligomeren, maar ook lipiden, bacteriofagen, virussen en cellen. Het platform voor affiniteitsmeting kan een basis vormen voor affiniteitsonderzoek naar geneesmiddelen en screening, de ontdekking van antilichamen en het faciliteren van vervolgonderzoek.

Inleiding tot bindingsaffiniteit

Affiniteit is belangrijk bij de evaluatie van intermoleculaire interacties, affiniteitsassays voor geneesmiddelen en geneesmiddelenscreening. Intermoleculaire interacties kunnen worden beschreven door de vergelijking: L + R = LR, waarbij L staat voor vrije liganden, R voor ongebonden receptoren en LR voor gebonden ligand-receptorcomplexen. Bindingsreacties definiëren intermoleculaire interacties, waarbij dynamische uitwisseling plaatsvindt tussen gebonden en ongebonden toestanden gedurende de reactie totdat evenwicht is bereikt. Dit kan worden beschreven door de twee snelheidsconstanten van de reactie: Kon (bindingssnelheidsconstante) en Koff (dissociatiesnelheidsconstante). De Kd-waarde, die het omgekeerde is van de bindingsconstante (Ka), is Koff/Kon, een belangrijke constante voor de reactieaffiniteit. Hoe sterker de binding tussen twee moleculen, hoe hoger de affiniteit. Hoe kleiner de Kd-waarde, hoe lager de affiniteit. Deze vergelijking kan worden weergegeven als een S-vormige curve op een semi-logaritmische grafiek, met de ligandconcentratie op de x-as (op de logaritmische schaalas) en de fractionele grens op de y-as. De stippellijn geeft de ligandconcentratie weer bij een Kd (1 nM) van 0,5 bindingsfractie.

Figuur 1: Sigmoïdale bindingscurve van variërende concentraties ligand gebonden aan celoppervlakreceptor. (Bron: Hunter SA, Cochran JR. Celbindingsassays voor het bepalen van de affiniteit van eiwit-eiwitinteracties: technologieën en overwegingen.)

Methoden voor het bepalen van affiniteit

ELISA-bindingsaffiniteitstest

De meest gebruikte techniek voor het bestuderen van antilichaamaffiniteit is de ELISA-methode, die zich kenmerkt door gebruiksgemak, snelheid, eenvoud, hoge gevoeligheid en sterke specificiteit. Met een kleine hoeveelheid reagentia (zoals antilichamen en antigenen) kan de antilichaamaffiniteit worden gemeten zonder dat zuiveringsreagentia nodig zijn. Door het antigeen op een vast oppervlak te immobiliseren en te detecteren met een primair antilichaam, reageert het gelabelde secundaire antilichaam met het primaire antilichaam. De gegevens worden vervolgens afgelezen en geanalyseerd in een ELISA-lezer.

Figuur 2: ELISA-achtige testen om de binding van de ontworpen peptiden aan hun doelen te evalueren. (Referentiebron: Hajikarimlou, Maryam, et al., 2022. Een computationele benadering voor het snel ontwerpen van peptiden die het SARS-CoV-2-oppervlakte-eiwit S detecteren.)

Oppervlakteplasmonresonantie (SPR) bindingsaffiniteitsassay

SPR-technologie detecteert voornamelijk veranderingen in de brekingsindex. Met behulp van traditionele optische verschijnselen en het resonantieverschijnsel van licht kan een biosensoranalysetechnologie voor de interactie tussen biomoleculen worden ontwikkeld om de interactie tussen liganden en analyten op biosensorchips te detecteren. Specifieke signalen van binding en interactie tussen biomoleculen kunnen worden verkregen door de dynamische veranderingen in SPR-hoeken tijdens biologische reacties te volgen.

Figuur 3: Oppervlakteplasmonresonantie (SPR)-analyse van de binding tussen H10 en AGR2. (Referentiebron: Garri, Carolina, et al., 2018. Identificatie, karakterisering en toepassing van een nieuw peptide tegen anterior gradient homoloog 2 (AGR2).)

Bio Layer Interference (BLI) bindingsaffiniteitsassay

Biofilminterferentietechnologie is een labelvrije, realtime optische detectietechniek die voornamelijk wordt gebruikt voor uitgebreide kwantitatieve analyse van intermoleculaire interacties en de bepaling van eiwitconcentraties. Deze technologie maakt gebruik van een probe-gebaseerde biosensor om veranderingen in de dikte van de biofilm op het monster direct te detecteren. Door de verschuivingen in het interferentiespectrum te meten, worden de binding en dissociatie tussen biomoleculen die op het sensoroppervlak interageren gedetecteerd en wordt de realtime verschuiving (nm) van het interferentiespectrum weergegeven.

Figuur 4: Biolayer-interferometrie (BLI)-analyse tussen aLDRG en chitinoligosacchariden. (Bron: Li, Bing, 2023. Kenmerken van het vergelijkende transcriptoom tussen rhizomorfen en hyfen van Armillaria sp. 541 die deelnemen aan schimmelsymbiose, met de nadruk op LysM-domeinen.)

Vergelijking van BLI- en SPR-technologie

Technologienaam	BLI (Bio-Layer Interferometry)	SPR (Oppervlakteplasmonresonantie)
Beginsel	Het meet veranderingen in het interferentiepatroon van gereflecteerd licht op het sensoroppervlak en detecteert moleculaire interacties via veranderingen in de optische dikte van de biolaag. Het levert een realtime bindingscurve (directe meting).	Het meet moleculaire interacties door signaalveranderingen in de brekingsindex nabij het oppervlak van de sensorchip te detecteren (dit treedt op wanneer licht interactie heeft met het grensvlak tussen goud en glas, waardoor de brekingsindex verandert). De gegevens worden weergegeven als veranderingen in de resonantiehoek (indirecte meting).
Fabrikant	Sartorius	GE
Instrument	ForteBio Biosensoren	Open SPR-instrument
Systeem	ForteBio Octet-systeem (voor analyse van moleculaire interacties)	TraceDrawer (ontwikkeld door Ridgeview Instruments, Zweden)
Voordelen	1. Brede compatibiliteit met diverse monsters, uitstekende stabiliteit, met name voor de detectie van kleine moleculen (de specifieke eisen voor monsterzuiverheid en bufferomstandigheden zijn minder streng). SSA-chips zijn kosteneffectief voor bindingsonderzoek. 2. Snellere doorvoer en kortere experimentele tijden in vergelijking met SPR.	1. Langere ontwikkelingsgeschiedenis, wat een hogere gevoeligheid oplevert in vergelijking met BLI. 2. Grotere precisie en robuustheid voor specifieke toepassingen, zoals het detecteren van zeldzame of waardevolle eiwitten met hogere affiniteits- en specificiteitsgegevens.
Nadelen	1. De nauwkeurigheid van de gegevens is iets lager in vergelijking met SPR. 2. Vereist zorgvuldig onderhoud van het instrument. 3. De kosten van de SSA-chip zijn relatief hoog.	1. De bufferomstandigheden voor het detecteren van zeer kleine moleculen kunnen veeleisend zijn, waardoor het risico op mislukte detectie toeneemt. 2. Chips zijn over het algemeen duurder dan de chips die in BLI worden gebruikt. 3. Verdamping van het monster tijdens langdurige experimenten kan een probleem vormen.
Chiptype	SSA-chip	NTA-chip

Omvang van de affiniteitsmeting

Affiniteitsbepaling kan plaatsvinden tussen antigeen en antilichaam (sterk antigeen-antilichaam, zwak antigeen-antilichaam), eiwit en eiwit, eiwit en peptide, eiwit en klein molecuul, en eiwit-DNA/RNA (aptameer). Bij het meten van de KD-waarde is het noodzakelijk om een van de molaire concentraties te kennen. Wanneer kleine moleculen binden, mag het molecuulgewicht van een van deze moleculen niet lager zijn dan 150 dalton.

Type	Domein	Voorzorgsmaatregelen
1. Antigeen-antilichaam	10^-6 tot 10^-12	De Kd-waarden van de meeste antilichamen liggen tussen de 10⁻⁶, 10⁻⁷ en 10⁻⁹. Over het algemeen wordt aangenomen dat antilichamen met een hoge affiniteit een waarde hebben tussen de 10⁻⁹ en 10⁻¹².
2. Eiwit - Kleine moleculen	10^-4 tot 10^-5	De KD-waarde van kleine moleculen en eiwitten ligt tussen 10^-4 en 10^-5, terwijl 10^-3 en 10^-7 normaal zijn en niet hoger kunnen zijn dan 10^-10. Covalente kleine moleculen kunnen een omvang van 10^-10 bereiken.
3. Avidine-biotine	10^-14	Affiniteit kan gemakkelijk niet-specifieke binding ondergaan, en streptavidine of gedeglycosyleerde affiniteit kan worden gebruikt.
4. DNA-eiwit	10^-8 tot 10^-10	Hoogwaardig en compleet DNA; let op dat de elektroforese de resultaten niet beïnvloedt.

Monstervereisten voor affiniteitsbepaling

Steekproef	Vereisten
1. Groot molecuulmonster	Eiwit > 50 µg, antilichaam > 100 µg, gebiotinyleerd eiwit > 200 µg; eiwit zonder biotine > 2 mg, zuiverheidseis > 90%, bufferoplossing: PBS, HEPBS. Mag geen imidazoolgroepen bevatten; kwaliteitscontrole is vereist.
2. Monster van een klein molecuul	Hoeveelheid > 1 mg, poeder of vloeistof. De vloeistof moet oplosbaar zijn in water of DMSO. Probeer geen glycerol, imidazool, trehalose of andere zouten te bevatten; probeer reagentia met aminogroepen zoals Tris in de buffer te vermijden. Gebruik over het algemeen PBS, HEPPS, enz., zonder organische reagentia.

Voordelen van het Affinity Measurement Platform

Analyse van meerdere monsters

Alpha Lifetech kan affiniteitsassays leveren voor diverse monsters, waaronder antilichamen, cellen, eiwitten en andere biomoleculen.

Volwaardig technologieplatform

We beschikken over geavanceerde technologieën zoals spr binding assay, bli binding assay en elisa binding assay.

Flexibele projectselectie

Klanten kunnen kiezen tussen snelle affiniteitsbepaling en nauwkeurige affiniteitsbepaling.

Zeer nauwkeurige resultaten

Ons professionele technische team kan zorgen voor efficiënte, nauwkeurige en betrouwbare resultaten bij de bepaling van verwantschapswaarden.

CasestudyGEVAL

BLI snelle affiniteitstest antilichaam- en aptameer-affiniteitstest

Vang gebiotinyleerde aptameren met SA-sondespecificiteit op en los ze op. Los het monster op en verdun het tot een vaste concentratie, laat de sondespecifieke, gevangen Target 1-5 aptameren stollen en bind ze na signaalverzadiging aan het monster. Voeg ze vervolgens toe aan een 96-wells plaat.

Figuur 5: Verdeling van detectieposities voor monsters in 96-wells platen. B verwijst naar de buffer die wordt gebruikt voor het balanceren en dissociëren van sensoren. L: Biotine Target 1-5 aptameren, 221: Monster.

Besteed aandacht aan het boren om de stabiliteit en nauwkeurigheid van de gegevens te waarborgen, en stel het bijbehorende programma in om de resultaten te verkrijgen:

Figuur 6: Interactie-aanpassingsdiagram tussen Target 1, 2 en 3 aptameren en monsters. (CH 1 \ 3 \ 5 vertegenwoordigt het signaal en de gegevens van de interactie tussen de gestolde Target 1 \ 2 \3 aptamer-sonde en het monster.)

Figuur 7: Interactie-aanpassingsdiagram tussen Target 4- en 5-aptameren en monsters. (CH 1 \ 3 vertegenwoordigt het signaal en de gegevens van de interactie tussen de gestolde Target 4 \ 5-aptameerprobe en het monster.)

de resultaten tonen aan

De volgende resultaten werden verkregen: De affiniteit van de Target 1-adapter voor het monster na aanpassing was 9,41 ^ -8; de affiniteit van de Target 2-adapter voor het monster na aanpassing is 8,32 ^ -8; de affiniteit van de Target 3-adapter voor het monster na aanpassing is 8,64 ^ -8; de affiniteit van de Target 4-adapter voor het monster na aanpassing is 3,70 ^ -8; de affiniteit van de Target 5-adapter voor het monster na aanpassing is 3,01 ^ -8.

Heeft u vragen? Neem dan gerust contact met ons op.

Leave Your Message

Uitgelichte service

0102