Affiniteitsmeetplatform
Alpha Lifetech kan betrouwbare affiniteitsbepalingsdiensten leveren op basis van het Octet- en Biacore-T2000-platform.
NEEM CONTACT MET ONS OP01
Affiniteitsmeetplatform
Alpha Lifetech kan betrouwbare affiniteitsbepalingen uitvoeren op basis van het Octet- en Biacore-T2000-platform. We kunnen affiniteitsbepalingen uitvoeren voor meerdere monsters, zoals antilichamen, cellen, eiwitten, kleine moleculen, enz. Er bestaan verschillende methoden voor affiniteitsbepaling, waaronder oppervlakteplasmonresonantie (SPR) en biolaaginterferentie (BLI).
Alpha Lifetech beschikt over een professioneel en nauwkeurig platform voor affiniteitsbepaling dat ELISA combineert met affiniteitsbepaling en zo professionele, efficiënte, snelle en precieze resultaten voor affiniteitsbepaling levert aan klanten wereldwijd. We bieden klanten twee methoden waaruit ze kunnen kiezen: snelle affiniteitsbepaling en nauwkeurige affiniteitsbepaling. Snelle affiniteitsbepaling is een bepaling van één concentratie, terwijl nauwkeurige affiniteitsbepaling de affiniteit van verschillende concentraties kan meten. Toegepast op de studie van interacties tussen verschillende kleine moleculen, peptiden, eiwitten, oligonucleotiden en oligomeren, evenals lipiden, bacteriofagen, virussen en cellen. Het affiniteitsmeetplatform kan de basis leggen voor affiniteitstests en -screening voor geneesmiddelen, de ontdekking van antilichamen en daaropvolgend onderzoek vergemakkelijken.
Inleiding tot bindingsaffiniteit
Affiniteit is belangrijk bij het evalueren van intermoleculaire interacties, affiniteitstests voor geneesmiddelen en screening van geneesmiddelen. Intermoleculaire interacties kunnen worden beschreven met de vergelijkingen: L + R = LR, waarbij L staat voor vrije liganden, R voor ongebonden receptoren en LR voor gebonden ligand-receptorcomplexen. Bindingsreacties definiëren intermoleculaire interacties, waarbij dynamische uitwisseling plaatsvindt tussen gebonden en ongebonden toestanden tijdens de reactie totdat een evenwicht is bereikt. Dit kan worden beschreven door de twee snelheidsconstanten, Kon (bindingssnelheidsconstante) en Koff (dissociatiesnelheidsconstante), van de reactie. De Kd-waarde, de reciproke waarde van de bindingsconstante (Ka), is Koff/Kon, een belangrijke constante voor de reactieaffiniteit. Dus hoe sterker de binding tussen twee moleculen, hoe hoger de affiniteit. Hoe kleiner de Kd-waarde, hoe omgekeerd. Deze vergelijking kan worden weergegeven als een S-vormige curve op een semi-logaritmische grafiek, met de ligandconcentratie op de x-as (op de logaritmische schaal) en de fractionele grens op de y-as. De stippellijn geeft de ligandconcentratie weer bij een Kd (1 nM) van 0,5 bindingsfractie.
Figuur 1: Sigmoïdale bindingscurve van verschillende concentraties ligand gebonden aan celoppervlakreceptor. (Referentiebron:Hunter SA, Cochran JR. Celbindingsassays voor het bepalen van de affiniteit van eiwit-eiwitinteracties: technologieën en overwegingen.)
Methoden voor het bepalen van affiniteit
ELISA-bindingsaffiniteitstest
De veelgebruikte techniek voor het bestuderen van antilichaamaffiniteit is gebaseerd op de ELISA-methode, die wordt gekenmerkt door gemak, snelheid, eenvoud, hoge gevoeligheid en sterke specificiteit. De ELISA-methode kan een kleine hoeveelheid reagentia (antilichamen en antigenen) gebruiken en de antilichaamaffiniteit meten zonder de noodzaak van zuiveringsreagentia. Door het antigeen te immobiliseren op een vast oppervlak en het te detecteren met een primair antilichaam, reageert het gelabelde secundaire antilichaam met het primaire antilichaam om de gegevens te lezen en te analyseren in een ELISA-lezer (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
Figuur 2: ELISA-achtige testen om de binding van de ontworpen peptiden aan hun doelen te evalueren. (Referentiebron:Hajikarimlou, Maryam, et al., 2022. Een computationele aanpak voor het snel ontwerpen van peptiden die SARS-CoV-2-oppervlakte-eiwit S detecteren.)
Oppervlakteplasmonresonantie (SPR) bindingsaffiniteitstest
SPR-technologie detecteert voornamelijk veranderingen in de brekingsindex. Met behulp van traditionele optische verschijnselen en het resonantieverschijnsel van licht kan een biosensoranalysetechnologie voor de interactie tussen biomoleculen worden ontwikkeld om de interactie tussen liganden en analyten op biosensorchips te detecteren. Specifieke signalen van binding en interactie tussen biomoleculen kunnen worden verkregen door de dynamische veranderingen in SPR-hoeken tijdens biologische reacties te monitoren.
Figuur 3: Oppervlakte-plasmonresonantie (SPR)-analyse van H10/AGR2-binding. (Referentiebron:Garri, Carolina, et al., 2018. Identificatie, karakterisering en toepassing van een nieuw peptide tegen anterior gradient homoloog 2 (AGR2).)
Bio Layer Interference (BLI) bindingsaffiniteitstest
Biofilminterferentietechnologie is een labelvrije, realtime optische detectietechniek voor monitoring, die voornamelijk wordt gebruikt voor uitgebreide kwantitatieve analyse van intermoleculaire interacties en bepaling van eiwitconcentraties. Deze technologie maakt gebruik van een probegebaseerde biosensor om veranderingen in de dikte van de biofilm op het monster direct te detecteren. Door de verplaatsingsveranderingen van het interferentiespectrum te detecteren, worden de binding en dissociatie tussen biomoleculen die op het sensoroppervlak interacteren, gedetecteerd en wordt de realtime verplaatsing (nm) van het interferentiespectrum weergegeven.
Figuur 4: Biolaaginterferometrie (BLI)-test tussen aLDRG en chitinoligosacchariden. (Referentiebron:Li, Bing, 2023. Kenmerken van vergelijkend transcriptoom tussen rhizomorfen en hyfen van Armillaria sp. 541 die deelnemen aan schimmelsymbiose met de nadruk op LysM-domeinen.)
Vergelijking van BLI- en SPR-technologie
| Technologie Naam | BLI (Bio-Layer Interferometrie) | SPR (oppervlakteplasmonresonantie) |
|---|---|---|
| Beginsel | Meet veranderingen in het interferentiepatroon van gereflecteerd licht op het sensoroppervlak en detecteert moleculaire interacties via veranderingen in de optische dikte van de biolaag. Het biedt een realtime bindingscurve (directe meting). | Meet moleculaire interacties door signaalveranderingen in de brekingsindex nabij het oppervlak van de sensorchip te detecteren (treedt op wanneer licht in wisselwerking staat met de grensvlakken van goud en glas, waardoor veranderingen in de brekingsindex ontstaan). Gegevens worden weergegeven als veranderingen in de resonantiehoek (indirecte meting). |
| Fabrikant | Sartorius | GE |
| Instrument | ForteBio Biosensoren | Open SPR-instrument |
| Systeem | ForteBio Octet-systeem (voor moleculaire interactieanalyse) | TraceDrawer (ontwikkeld door Ridgeview Instruments, Zweden) |
| Voordelen | 1. Brede monstercompatibiliteit, uitstekende stabiliteit, met name voor de detectie van kleine moleculen (specifieke eisen aan de zuiverheid van het monster en de buffercondities zijn minder streng). SSA-chips zijn kosteneffectief voor bindingsstudies. 2. Snellere doorvoer en kortere experimentele tijden vergeleken met SPR. | 1. Langere ontwikkelingsgeschiedenis, met hogere gevoeligheid in vergelijking met BLI. 2. Grotere precisie en robuustheid voor specifieke toepassingen, zoals het detecteren van zeldzame of waardevolle eiwitten met gegevens over hogere affiniteit en specificiteit. |
| Nadelen | 1. De dataprecisie is iets lager vergeleken met SPR. 2. Vereist zorgvuldig onderhoud van het instrument. 3. De kosten van SSA-chips zijn relatief hoog. | 1. Bufferomstandigheden voor het detecteren van zeer kleine moleculen kunnen veeleisend zijn, waardoor het risico op detectiefalen toeneemt. 2. Chips zijn over het algemeen duurder dan die gebruikt in BLI. 3. Verdamping van monsters kan tijdens uitgebreide experimenten een probleem zijn. |
| Chiptype | SSA-chip | NTA-chip |
Bereik van affiniteitsmeting
Affiniteitsbepaling kan antigeen-antilichaam (sterk antigeen-antilichaam, zwak antigeen-antilichaam), eiwit-eiwit, eiwit-peptide, eiwit-klein molecuul en eiwit-DNA/RNA (aptameer) omvatten. Bij het meten van de kD is het noodzakelijk om één van de molaire concentraties te kennen. Wanneer kleine moleculen binden, mag één molecuulgewicht niet kleiner zijn dan 150 dalton.
| Type | Domein | Voorzorgsmaatregelen |
|---|---|---|
| 1. Antigeen-antilichaam | 10^-6 tot 10^-12 | De Kd-waarden van de meeste antilichamen liggen tussen 10^-6, 10^-7 en 10^-9. Algemeen wordt aangenomen dat antilichamen met hoge affiniteit binnen de 10^-9 liggen, terwijl antilichamen met hoge affiniteit binnen de 10^-12 liggen. |
| 2. Eiwit - Kleine moleculen | 10^-4 tot 10^-5 | De KD van kleine moleculen en eiwitten ligt tussen 10^-4 en 10^-5, terwijl 10^-3 en 10^-7 normaal zijn en de 10^-10 niet kunnen bereiken. Covalente kleine moleculen kunnen een getal van 10^-10 bereiken. |
| 3. Avidine-Biotine | 10^-14 | Affiniteit kan eenvoudig een niet-specifieke binding ondergaan, en streptavidine of gedeglycosyleerde affiniteit kan worden gebruikt. |
| 4. DNA-eiwit | 10^-8 tot 10^-10 | Hoogwaardig en compleet DNA; let op dat u de invloed van elektroforese niet ondervindt. |
Voorbeeldvereisten voor affiniteitsbepaling
| Steekproef | Vereisten |
|---|---|
| 1. Groot moleculair monster | Eiwit > 50 µg, antilichaam > 100 µg, gebiotinyleerd eiwit > 200 µg; eiwit zonder biotine > 2 mg, zuiverheidsvereiste > 90%, bufferoplossing: PBS, HEPBS. Mag geen imidazolgroepen bevatten; kwaliteitscontrole is vereist. |
| 2. Klein molecuulmonster | Hoeveelheid> 1 mg, poeder of vloeistof. Vloeistof moet oplosbaar zijn in water of DMSO. Probeer geen glycerol, imidazool, trehalose of andere zouten te gebruiken; vermijd reagentia met aminogroepen zoals Tris in de buffer, over het algemeen PBS, HEPPS, enz. zonder organische reagentia. |
Analyse van meerdere monsters
Alpha Lifetech kan affiniteitstests leveren voor verschillende monsters, waaronder antilichamen, cellen, eiwitten en andere biomoleculen.
Volwassen technologieplatform
Wij beschikken over geavanceerde technologieën zoals de spr-bindingsassay, de bli-bindingsassay en de elisa-bindingsassay.
Flexibele projectselectie
Klanten kunnen kiezen tussen snelle affiniteitsbepaling en nauwkeurige affiniteitsbepaling.
Resultaten met hoge precisie
Ons professionele technische team kan efficiënte, nauwkeurige en betrouwbare resultaten voor affiniteitsbepaling garanderen.
CasestudyGEVAL
BLI snelle affiniteitstest antilichaam en aptamer affiniteitstest
Vang gebiotinyleerde aptameren met SA-probespecificiteit op en los ze op. Los het monster op en verdun het tot een vaste concentratie, laat de probe-specifieke Target 1-5 aptameren stollen en bind ze na signaalverzadiging aan het monster. Voeg ze vervolgens toe aan een 96-wellsplaat.
Figuur 5: Verdeling van detectieposities voor monsters van 96-wellsplaten. B verwijst naar de buffer die wordt gebruikt voor het balanceren en dissociëren van sensoren. L: Biotine Target 1-5 aptameren, 221: Monster.
Besteed aandacht aan het boren om de stabiliteit en nauwkeurigheid van de gegevens te garanderen en stel het bijbehorende programma in om de resultaten te verkrijgen:
Figuur 6: Interactie-diagram tussen Target 1, 2 en 3 aptameren en monsters. (CH 1 \ 3 \ 5 geeft het signaal en de gegevens weer van de interactie tussen de gestolde Target 1 \ 2 \ 3 aptameren-sonde en het monster.)
Figuur 7: Interactie-fittingdiagram tussen Target 4 en 5 aptameren en monsters. (CH 1 \ 3 vertegenwoordigt het signaal en de gegevens van de interactie tussen de gestolde Target 4 \ 5 aptamer-sonde en het monster.)
resultaten tonen aan
De volgende resultaten werden verkregen: De affiniteit van de Target 1-adapter tot het monster na aanpassing was 9,41 ^ -8; de affiniteit van de Target 2-adapter tot het monster na aanpassing was 8,32 ^ -8; de affiniteit van de Target 3-adapter tot het monster na aanpassing was 8,64 ^ -8; de affiniteit van de Target 4-adapter tot het monster na aanpassing was 3,70 ^ -8; de affiniteit van de Target 5-adapter tot het monster na aanpassing was 3,01 ^ -8.
Indien u vragen heeft, kunt u te allen tijde contact met ons opnemen.
Leave Your Message
2018-07-16 
0102