Platform voor dierimmunisatie

De dierlijke bronnen van Alpha Lifetech zijn transparant, met inspectie- en quarantainevergunningen, duidelijke genetische achtergronden, een heldere vaccinatiefrequentie en gedetailleerde registraties van vaccinatie-intervallen. Dit biedt handige diensten voor de productie van antilichamen. Alpha Lifetech vaccineert voornamelijk kameelachtigen (alpaca's, liama's en kamelen), waarmee de basis wordt gelegd voor de productie van nanobodies. Daarnaast kunnen we ook gewone dieren (zoals Nieuw-Zeelandse witte konijnen, muizen en andere dieren) vaccineren, afhankelijk van de gewenste vaccinatiefrequentie en immunogeniteitseisen van de klant. We extraheren en isoleren de PBMCs (perifere bloedmonocyten) en gebruiken deze voor vervolgonderzoeken (zoals de ontwikkeling van monoklonale en polyklonale antilichamen). Klanten kunnen hun eigen immunogenen aanleveren, die we vervolgens streng controleren op kwaliteit. Indien klanten virale immunogenen aanleveren, moeten deze worden geïnactiveerd. We voeren hiervoor een inactivatietest uit om de veiligheid te garanderen. Tegelijkertijd kunnen we ook immunogenen op maat maken, afhankelijk van de behoeften van de klant.

Inleiding tot dierimmunisatie

Bij de productie van dierlijke antilichamen, zoals monoklonale antilichamen, polyklonale antilichamen en nanobodies, is de eerste stap het immuniseren van de dieren om de corresponderende B-cellen, antilichamen of PBMCs te verkrijgen. Deze worden vervolgens gebruikt voor verdere antilichaamproductie, het bevorderen van fundamenteel wetenschappelijk onderzoek, de ontwikkeling van klinische diagnostische instrumenten en het faciliteren van de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Kamelen, alpaca's, liama's en andere kameelachtigen kunnen nanobody-bibliotheken (enkelvoudige domein-antilichamen) produceren door middel van immuunbloedafname en extractie van PBMCs. Konijnen en andere dieren kunnen worden geïmmuniseerd en antilichamen kunnen uit hun lichaam worden geëxtraheerd. Na zuivering kunnen deze worden gebruikt voor de productie van polyklonale antilichamen. Muizen, ratten, enz. kunnen worden gebruikt voor de productie van monoklonale antilichamen door immuun-geëxtraheerde B-cellen te fuseren met myeloomcellen. Vóór de immunisatie moet aandacht worden besteed aan de 3R-principes (vervanging, vermindering, verfijning). Deze principes kunnen het aantal gebruikte dieren aanzienlijk verminderen tot het noodzakelijke minimum, de experimentele procedures verbeteren en het dierenleed minimaliseren. Een correct experimenteel ontwerp, de selectie van geschikte antilichamen en strikte validatieprocedures moeten eveneens worden gevolgd.

Classificatie van immunogenen - nanobody-productie

Soorten immunogenen	Voorbeeld	Immunogene bereiding	Notities
Eiwit-immunogenen	Enzymen, eiwitten, bacteriële toxines en andere stoffen	Kies verschillende eiwitexpressiesystemen: E. coli, gist, insectencellen, zoogdiercellen en een celvrij systeem.	Besteed aandacht aan factoren zoals temperatuur, tijd, pH en insluitlichaampjes die de eiwitexpressie beïnvloeden.
Nucleïnezuur-immunogenen	DNA, RNA	DNA-immunogeen: construeer plasmide-DNA, kloon geschikte expressievectoren voor doelgenen, kweek cellen om plasmide-DNA te vermenigvuldigen en extraheer hoogzuiver plasmide-DNA. RNA-immunogeen: Er moet een hoedstructuur en een polyA-staart worden toegevoegd om afbraak te voorkomen.	Bij de bereiding van DNA-immunogenen moet rekening worden gehouden met de juiste gastheercellen, en bij de bereiding van RNA-immunogenen moet erop worden gelet dat RNA-afbraak wordt voorkomen.
Virale immunogenen	Geïnactiveerd vaccin met heel virus, subunitvaccin, vaccin met virale vector (adenovirus, lentivirus, enz.), mRAN-vaccin.	Bij de bereiding van een vaccin op basis van een geïnactiveerd heel virus wordt het virus eerst geïnactiveerd om de veiligheid te verhogen. Toxiciteitstesten worden gebruikt om te bepalen of de inactivatie volledig is. Subunitvaccins hebben alleen virusoppervlakte-eiwitten als antigenen nodig en moeten rekening houden met de immuunrespons.	Er moeten hulpstoffen worden toegevoegd om immuuneffecten te bewerkstelligen, er moet aandacht worden besteed aan het virus dat moet worden geïnactiveerd, de juiste virustiters zijn vereist om immuuneffecten te garanderen, en de veiligheid van het bereidingsproces moet strikt worden gecontroleerd.

Proces of tijdlijn voor de immunisatie van dieren

Dierselectie en antigeenbereiding

Dierselectie: Selecteer alpaca's van de juiste leeftijd en met een gezonde lichaamsbouw uit gezonde groepen, en voer bloedonderzoek en ziekteonderzoek uit om er zeker van te zijn dat er geen infectieziekten of andere gezondheidsproblemen zijn.

Immunogeenbereiding: Immunogenen zijn essentieel voor het opwekken van immuunreacties en vereisen de selectie van geschikte eiwitten, peptiden of andere geschikte stoffen op basis van de vereisten van het beoogde antilichaam.

Een alpaca kan gelijktijdig met 1-3 antigenen worden geïmmuniseerd, met een totale hoeveelheid antigeen van 1-2 mg per immunisatie en een volume van minder dan 2 ml. Vóór de immunisatie worden het antigeen en het adjuvans in een verhouding van 1:1 geëmulgeerd tot een homogeen mengsel, dat bij 4 ℃ wordt bewaard.

Immunologische alpaca

Noteer het blanco oornummer van de alpaca en start het immunisatie-experiment. Injecteer in de lymfeklieren nabij de nek van de alpaca aan beide zijden, met 2 injectiepunten aan elke kant en ongeveer 0,4 ml geëmulgeerd antigeen per injectiepunt. Observeer de alpaca na de immunisatie gedurende een half uur om te controleren of deze geen ongemaksverschijnselen vertoont. De immunisatie moet elke 2 weken worden herhaald, met een minimum van 4 injecties.

Bloedafname

Na 4 vaccinaties gedurende 5-7 dagen, neem je 50 ml bloed af uit de halsader van de alpaca.

Serumscheiding

Voor elke antigeenimmunisatie worden bloedmonsters afgenomen voor immuunonderzoek, waarbij telkens 5 ml bloed wordt afgenomen. Op dezelfde dag wordt het bloed gedurende 30 minuten gecentrifugeerd bij 400 xg in een voorgekoelde centrifuge van 25 ℃. De bovenste serumlaag wordt afgescheiden en bewaard voor latere bepaling van de antilichaamtiter.

Gescheiden lymfocyten

Voeg eerst 15 ml celseparatieoplossing toe aan een centrifugebuis van 50 ml en voeg vervolgens langzaam 15 ml bloed toe. Wees voorzichtig en langzaam bij het toevoegen van bloed om te voorkomen dat bloed en scheidingsoplossing zich mengen. Centrifugeer de buis voor op 25 °C, centrifugeer vervolgens 30 minuten bij 400 xg en bewaar het bovenste serum in een nieuwe centrifugebuis bij -80 °C. Gebruik een pipet om de middelste, katoenachtige, bovenste laag immuuncellen op te zuigen in een nieuwe centrifugebuis van 50 ml. Voeg aan elke buis 10 ml PBS-buffer op kamertemperatuur toe en centrifugeer 20 minuten bij 25 °C en 400 xg. Verwijder het supernatant, voeg 5 ml PBS-buffer op kamertemperatuur toe aan elke buis, meng voorzichtig en bepaal het aantal cellen met een hemocytometer. Centrifugeer vervolgens nogmaals 20 minuten bij 25 °C en 400 xg. Verwijder de supernatant en los de lymfocyten op die verkregen zijn met RNAiso Plus, op basis van het aantal cellen, om een cellysaat van 10^7/ml te verkrijgen, dat wordt bewaard bij -80 ℃.

Figuur 1: Schematische weergave van verschillende strategieën voor de ontdekking van antilichamen en de bijbehorende experimentele fasen. (Bron afbeelding: Laustsen, Andreas H. et al.)

Klanten leveren immunogenen aan - strenge kwaliteitscontrole

Soorten immunogenen	Vereiste	Kwaliteitscontrolemethode
Peptide-/kleine molecuulmonsters	Oplossingsomstandigheden (voornamelijk afhankelijk van of ze fagen inactiveren), moleculaire structuur/peptidevolgorde, syntheseverslag (HPLC/MS/HNMR)	HPLC/MS-detectie
Eiwitmonsters	SDS-PAGE/WB, reconstitutieomstandigheden, buffer, labelinformatie, totale hoeveelheid (20-50 µg), concentratie, zuiverheid, enz.	SDS-PAGE/WB
Celmonsters	Celtype (primaire cellen/genetisch gemodificeerde cellen), celvorm (vers/bevroren en ontdooid), groeitype (adherent/suspenderend), vereisten voor kweekmedium, aantal geleverde cellen, genetisch gemodificeerde cellen om stabiele expressie van screeningdoelen te garanderen (klantovereenkomend primair antilichaam), bevroren en ontdooide cellen om het herstelpercentage te bepalen	We richten ons voornamelijk op genetisch gemodificeerde cellen, waarbij we gebruikmaken van door de klant aangeleverde primaire antilichamen voor ELISA-identificatie van de doelwitexpressie (ons bedrijf levert HRP-secundaire antilichamen) en flowcytometrische detectie (ons bedrijf kan fluorescerende secundaire antilichamen leveren).

Wat zijn de toepassingen van dierlijke immuniteit?

+

Polyklonale antilichamen kunnen worden geproduceerd door dieren te immuniseren, monoklonale antilichamen kunnen worden geproduceerd door B-cellen te fuseren met myeloomcellen, en PBMCs kunnen worden geëxtraheerd uit kameelachtige bronnen (alpaca, kameel, alpaca, enz.) om verschillende vormen van antilichaamfragmenten te produceren, zoals nanobodies, Fab-fragmenten, scFv-antilichaamfragmenten, enz.
Welke voorzorgsmaatregelen zijn er nodig om de immuniteit van dieren te waarborgen?

+

Voor de productie van nano-antilichamen voor dieren afkomstig van kamelen zijn 5-6 vaccinaties nodig. Vóór de vaccinatie moeten bloedmonsters als controle worden afgenomen, met een interval van 2 weken tussen elke vaccinatie. Na de vierde vaccinatie moeten positief bloed en negatief bloed van niet-gevaccineerde dieren worden afgenomen voor ELISA om de titer te bepalen. Als de titer lager is dan 10⁶, moet het aantal vaccinaties worden verhoogd totdat de titer een geschikt niveau bereikt. Bij andere diervaccinaties, zoals konijnenvaccinatie (het optimale of gebruikelijke niveau van eiwitantigeen voor konijnenvaccinatie is 50-1000 µg), muizenvaccinatie (het optimale of gebruikelijke niveau van eiwitantigeen voor muizenvaccinatie is 5-50 µg, wat neerkomt op 10⁶ cellen als het om een cel gaat, en 10-50 µg voor nucleïnezuur of koolhydraten), geitenvaccinatie (het optimale of gebruikelijke niveau van eiwitantigeen voor geitenvaccinatie is 250-5000 µg), enzovoort, moet aandacht worden besteed aan de dosering, veiligheid en werkzaamheid van de immunogenen.
Hoe kies je dieren met een hoog immuunsysteem?

+

Afhankelijk van het type antilichaam dat de klant nodig heeft, kunt u, als u nanobodies of andere antilichaamfragmenten wilt produceren, kiezen voor dieren van kameelafkomst (kamelen, alpaca's, enz.) voor immunisatie. Als u monoklonale of polyklonale antilichamen wilt produceren, moet u de juiste diersoort selecteren op basis van de hoeveelheid serum, het antigeen en de antigeenbron. De maximale hoeveelheid serum voor konijnen is 500 ml, wat een lage hoeveelheid antigeen vereist en de eerste keuze is voor de productie van polyklonale antilichamen. De maximale hoeveelheid serum voor muizen is 2 ml en voor ratten 20 ml, wat doorgaans de optimale keuze is voor monoklonale antilichamen. Antilichamen geproduceerd door geiten hebben een hoge affiniteit en Alpha Lifetech kan een exclusief immunisatieplan op maat voor u samenstellen, afgestemd op uw specifieke wensen.
Moeten antigenen samen met adjuvantia worden gebruikt? Hoe maak je de juiste keuze?

+

Er bestaan twee soorten adjuvantia: op oliebasis en op waterbasis. Een verstandig gebruik van adjuvantia is cruciaal voor het opwekken van sterke antilichaamreacties op oplosbare antigenen. De langzame afgifte van adjuvantia betekent dat er minder doses antigenen nodig zijn en dat de antilichaamreacties langer aanhouden. De eerste injectie moet in combinatie met een adjuvans worden toegediend. Over het algemeen wordt het gebruik van Freund's adjuvans aanbevolen wanneer de hoeveelheid immunogeen klein is.
Voorzorgsmaatregelen bij de vaccinatie van alpaca's?

+

(1) De selectie van de alpaca en het immuniteitsantigeen zijn cruciaal voor een succesvolle immunisatie. Het kiezen van een goed geproportioneerde kameel is niet aan te raden. De zuiverheid en de juiste conformatie van de immuunantigenen zijn essentieel voor het screenen van geschikte antilichamen voor latere toepassingen na immunisatie met alpaca's. De zuiverheid van de eiwitantigenen is over het algemeen niet minder dan 90%.

(2) Scheiding van lymfocyten: Tijdige celscheiding kan hemolyse na bloedafname effectief voorkomen en zo het beste scheidingsresultaat bereiken.

(3) De immuuncyclus kan de immuunrespons beïnvloeden: een immuuninterval van 1-2 weken zorgt ervoor dat alpaca's een goede immuunrespons hebben op de meeste antigenen.

onafhankelijk ontwikkeld adjuvans

Onze unieke adjuvansformule is geoptimaliseerd voor het immuunsysteem van de alpaca en biedt een hogere werkzaamheid en specificiteit dan traditionele adjuvantia.

Vaccinatie
standaard

Wij garanderen dat de vaccinatie binnen de gestelde tijd voltooid zal zijn, dat we serum met een hoge titer zullen leveren en dat elke stap nauwkeurig zal worden vastgelegd in rapporten.

kwaliteitscontrole van het project

Elk project doorloopt strenge kwaliteitscontroles om te garanderen dat klanten antilichamen ontvangen die aan hoge eisen voldoen.

duidelijkAlpacaAchtergrond

We hebben een gezonde alpacapopulatie die ondersteuning biedt aan diverse vaccinatieprogramma's.

Heeft u vragen? Neem dan gerust contact met ons op.

Leave Your Message

Uitgelichte service

0102