Antilichaam-affiniteitsrijpingsservice

Alpha Lifetech Inc.Wij bieden diensten aan voor affiniteitsrijping van antilichamen met behulp van mutatie- en selectietechnologieën. We gebruiken doorgaans scFv als antilichaamformaat in de affiniteitsrijpingsprocessen en een monovalent display-fagemidsysteem om de aviditeitseffecten tijdens antigeenbindingsscreening te verminderen. Ons professionele team kan ook affiniteitsrijpingsdiensten leveren voor enkelvoudige domeinantilichamen.

Alpha Lifetech Inc.Wij zijn er trots op een uitgebreid dienstenpakket aan te bieden dat aansluit op de uiteenlopende behoeften van onze wereldwijde klanten. Ons doel is de eisen van verschillende klanten te begrijpen en daaraan te voldoen, en hen te ondersteunen bij eventuele toekomstige en opkomende problemen in hun onderzoek.

Wat is affiniteitsrijping?

Affiniteitsrijping is het proces waarbij antilichamen herhaaldelijk mutaties en selectie ondergaan om hun affiniteit voor specifieke antigenen te vergroten. Dit proces vindt voornamelijk plaats in het kiemcentrum van secundaire lymfoïde organen, waar B-cellen somatische hypermutatie en selectie ondergaan onder invloed van T-cellen en folliculaire dendritische cellen.
Tijdens het affiniteitsrijpingsproces worden B-cellen met immunoglobulinereceptoren met een lage affiniteit geactiveerd door de aanwezigheid van antigenen, waarna ze prolifereren en differentiëren. Door middel van somatische hypermutatie-affiniteitsrijping treden willekeurige nucleotideveranderingen op in het variabele gebied van immunoglobulinegenen, wat leidt tot de productie van verschillende antilichaamvarianten. Na somatische hypermutatie vindt antigeengestuurde selectie plaats op B-cellen met gemuteerde immunoglobulinereceptoren. B-cellen die antilichamen produceren met een verhoogde antigene affiniteit worden bij voorkeur behouden en mogen prolifereren, terwijl B-cellen met een verlaagde of onveranderde affiniteit apoptose ondergaan. Dit iteratieve proces van mutatie en selectie leidt tot de productie van B-celklonen die antilichamen produceren met een geleidelijk hogere affiniteit voor het antigeen.

Antilichaam-affiniteitsrijpingsservice

De belangrijkste voordelen van PCR-gebaseerde methoden zijn dat mutaties precies gericht zijn op het geamplificeerde fragment; de foutenmarge is gemakkelijk te beheersen en de methode is snel en eenvoudig op te zetten en maakt geen gebruik van gevaarlijke chemicaliën. Het is algemeen bekend dat Taq DNA-polymerase DNA met een lage getrouwheid dupliceert, voornamelijk vanwege het ontbreken van 3' tot 5' proofreading-activiteit.Alpha Lifetech'sHet platform voor antilichaamengineering maakt gebruik van een foutgevoelige PCR-benadering om voornamelijk CDR-regio's te muteren tijdens de constructie van subbibliotheken. Vaak worden mutaties aangebracht op volledig willekeurige posities in de gehele VH- en VL-fragmenten om de genetische diversiteit van de subbibliotheek te vergroten. Na de constructie van een gemuteerde antilichaamgenbibliotheek met behulp van foutgevoelige PCR, wordt de selectie van varianten met een hoge affiniteit (de affiniteit van de scFv-antilichamen kan 10^8 - 10^10 M bereiken) uitgevoerd door middel van panning in oplossing of op geïmmobiliseerd antigeen met wasomstandigheden die geoptimaliseerd zijn voor selectie op basis van de dissociatiesnelheid.
  
Wetenschappers inAlpha Lifetech Inc.Gebruik Escherichia coli-mutatorstammen mutAD5TM als een van de verschillende mutatiestrategieën om willekeurige mutaties te introduceren en zo de affiniteit en expressie van recombinante antilichaamfragmenten te modificeren. Selectieomstandigheden kunnen worden aangepast voor antilichaamfragmenten met verhoogde productieniveaus. Groeiomstandigheden in Escherichia coli-mutatorcellen kunnen worden aangepast om één willekeurige puntmutatie per kilobase DNA te introduceren, wat vrijwel gelijk is aan één codonverandering per scFv-fragment. Na meerdere cycli van mutatie, presentatie en selectie kunnen we de affiniteitsconstante verbeteren van 10^5 - 10^6 M naar 10^8 - 10^10 M.

Verbetering van strategieën voor affiniteitsrijping

Bepaalde posities van antilichamen kunnen met een gedefinieerde diversiteit worden gerandomiseerd (zoals volledige randomisatie met alle 20 aminozuren of biased randomisatie met geselecteerde aminozuren in vaste percentages) om de affiniteit te verbeteren. We hanteren twee strategieën om de antilichaamaffiniteit te verhogen: ten eerste worden mutaties geïntroduceerd op specifieke posities in de complementaire-bepalende regio's (CDR's) door middel van gerichte mutagenese; ten tweede worden mutaties geïntroduceerd in de gehele V-coderende regio's door middel van willekeurige mutagenese. Door deze twee methoden te gebruiken, worden de geconserveerde aminozuursequenties of het gehele frameworkgebied van het antilichaam vervangen door andere aminozuren. In combinatie met onze technologieën voor het scannen van peptidebibliotheken kan dit de affiniteit van de gewenste antilichamen aanzienlijk verhogen.

Fage Display-Antilichaam Affiniteit

Nadat de scFv-mutantenbibliotheek is samengesteld, zijn er twee screeningsstrategieën beschikbaar: biopanning en solid-antigen sorting. Bij de eerste strategie wordt een subtractieve concentratie van het substraat gebruikt om de antilichamen met hoge affiniteit te isoleren, aangezien de mutanten met lage affiniteit zouden worden weggewassen, waardoor de faagdeeltjes met hoge affiniteit overblijven. De tweede strategie maakt gebruik van een gelabeld antigeen in oplossing, selectie op basis van de evenwichtsconstante (Kd) en selectie op basis van bindingskinetiek. Deze selectiemethode isoleert antilichaamvarianten met een verbeterde Kd.

Heeft u vragen? Neem dan gerust contact met ons op.